刘亚君，修瑞娟

(中国医学科学院微循环研究所，北京100005)

Cyt C是一种水溶性的小分子蛋白质，分子量约为15 kD。正常情况下，Cyt C位于细胞线粒体内膜的嵴上，是线粒体电子传递链的组成部分，负责将电子由复合物Ⅲ传递到复合物Ⅳ［1］。Cyt C从线粒体释放到胞质，是线粒体途径细胞凋亡发生的关键步骤［2］。因此胞质中Cyt C的检测对于组织细胞凋亡及线粒体损伤的评价具有重要意义。然而，由于Cyt C分子量较小，Western blot转膜过程不好控制，给科研工作者带来一定困难。本研究通过提取大鼠小肠上皮细胞胞质蛋白，对比经过不同时间转膜后，Cyt C条带的深浅来确定最佳转膜时间，旨在为Western blot检测胞质中Cyt C提供一种新的实验条件。

1 材料与方法

1.1 样品制备 成年Wistar大鼠麻醉后，取小肠。载玻片刮取小肠上皮细胞。按1∶8比例加入匀浆液［250 mmol/L蔗糖，20 mmol/LHEPES-KOH，10 mmol/L KCl，

1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，1.8 mg/ml碘乙酰胺，1 mmol/L PMSF，10 μl/ml Protease inhibitor cocktail(P8340，Sigma)］，匀浆管中上下匀浆30次。4℃1 000 g离心10 min，取上清。4℃3 000 g离心15 min。取上清，4℃10 000 g离心15 min，将上清分装，－80℃储存备用。

1.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 样品按照Bradford法蛋白定量。采用15%SDS-PAGE分离胶，3%SDS-PAGE成层胶。取20 μg蛋白样品液于点样孔中，电压150 V，电泳30 min。

1.3 电转移及丽春红染色 取22 μm硝酸纤维素膜(NC膜)，电压100 V，分别电转移15、30、60、90、120 min。将每个时间点的NC膜浸入1%丽春红溶液中显色3 min，蒸馏水冲洗。

1.4 抗原抗体反应及显色 将丽春红染色的膜浸入1%吐温20、5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜数次。加入1∶300 Cyt C抗体(Pharmingen)，4℃ 孵育过夜。洗膜后加入1∶2 000辣根过氧化物酶标记的二抗(Santa Cruz Biotech)，室温孵育1 h，洗膜数次。将膜放入显色液中(Pierce)，室温下孵育5 min。放射自显影法显色。

2 结果

2.1 丽春红染色结果 见插页Ⅱ图5。随着电转移时间的增加，经丽春红染色的NC膜上蛋白质条带逐渐加深，电转移120 min时染色最深。……