刘亚君，修瑞娟

(中国医学科学院微循环研究所，北京100005)

Cyt C是一种水溶性的小分子蛋白质，分子量约为15 kD。正常情况下，Cyt C位于细胞线粒体内膜的嵴上，是线粒体电子传递链的组成部分，负责将电子由复合物Ⅲ传递到复合物Ⅳ［1］。Cyt C从线粒体释放到胞质，是线粒体途径细胞凋亡发生的关键步骤［2］。因此胞质中Cyt C的检测对于组织细胞凋亡及线粒体损伤的评价具有重要意义。然而，由于Cyt C分子量较小，Western blot转膜过程不好控制，给科研工作者带来一定困难。本研究通过提取大鼠小肠上皮细胞胞质蛋白，对比经过不同时间转膜后，Cyt C条带的深浅来确定最佳转膜时间，旨在为Western blot检测胞质中Cyt C提供一种新的实验条件。

1 材料与方法

1.1 样品制备 成年Wistar大鼠麻醉后，取小肠。载玻片刮取小肠上皮细胞。按1∶8比例加入匀浆液［250 mmol/L蔗糖，20 mmol/LHEPES-KOH，10 mmol/L KCl，

1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，1.8 mg/ml碘乙酰胺，1 mmol/L PMSF，10 μl/ml Protease inhibitor cocktail(P8340，Sigma)］，匀浆管中上下匀浆30次。4℃1 000 g离心10 min，取上清。4℃3 000 g离心15 min。取上清，4℃10 000 g离心15 min，将上清分装，－80℃储存备用。

1.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 样品按照Bradford法蛋白定量。采用15%SDS-PAGE分离胶，3%SDS-PAGE成层胶。取20 μg蛋白样品液于点样孔中，电压150 V，电泳30 min。

1.3 电转移及丽春红染色 取22 μm硝酸纤维素膜(NC膜)，电压100 V，分别电转移15、30、60、90、120 min。将每个时间点的NC膜浸入1%丽春红溶液中显色3 min，蒸馏水冲洗。

1.4 抗原抗体反应及显色 将丽春红染色的膜浸入1%吐温20、5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜数次。加入1∶300 Cyt C抗体(Pharmingen)，4℃ 孵育过夜。洗膜后加入1∶2 000辣根过氧化物酶标记的二抗(Santa Cruz Biotech)，室温孵育1 h，洗膜数次。将膜放入显色液中(Pierce)，室温下孵育5 min。放射自显影法显色。

2 结果

2.1 丽春红染色结果 见插页Ⅱ图5。随着电转移时间的增加，经丽春红染色的NC膜上蛋白质条带逐渐加深，电转移120 min时染色最深。

2.2 Cyt C放射自显影成像结果 大鼠小肠上皮细胞胞质蛋白经不同时间电转移后，于15 kD处出现一条特异性条带，见插页Ⅱ图6。由图6可见，Cyt C条带颜色在30 min和120 min较深，以120 min电转移得到的条带颜色最深。

3 讨论

Western blot方法作为一种敏感的蛋白质半定量技术，在分子生物学、生物化学和免疫遗传学中得到了广泛应用。

Cyt C是小分子蛋白，在Western blot的转膜过程中容易丢失，而关于通过Western blot检测细胞色素C的文献大多没有详细的转膜电压及转膜时间介绍。在转膜过程中，转膜时间随蛋白质分子量大小而变化，分子量小的蛋白质，其转膜时间相对较短［3］。本实验中我们选择15、30、60、90、120 min 5个转膜时间点来对比转膜蛋白条带及Cyt C条带的深浅，以确定最佳转膜时间。结果发现，NC膜经丽春红染色后，随着转膜时间的增加，蛋白条带颜色加深，15 min时最浅，120 min时最深。而Cyt C条带并不是随着转膜时间的增加而加深，出现了先增加(30 min)，后减少，再增加(120 min)的趋势，而在120 min时最深。我们分析，在转膜过程中，随着时间的增加，转移到NC膜的总蛋白增多，而对于小分子的Cyt C，虽然当转膜时间超过30 min后，一部分Cyt C穿过NC膜进入转膜液，但随着时间的延长，NC膜上Cyt C增加的量大于进入转膜液的Cyt C的量，因此保留在膜上的Cyt C逐渐增加，从而当转膜时间为120 min而不是30 min时，Cyt C的条带最深。

通过本实验，我们得出结论，Cyt C虽然是小分子量蛋白，但Western blot的最佳转膜时间并不需要减少，相反要增加到120 min才能得到最深的条带。

［1］Ow YP，Green DR，Hao Z，et al.Cytochrome c:functions beyond respiration［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(7):532-542.

［2］Christophe M，Nicolas S.Mitochondria:a target for neuroprotective interventions in cerebral ischemia-reperfusion［J］.Curr Pharm，2006，12(6):739-757.

［3］郑维.汉英医学分子生物学实验方法［M］.北京:中国协和医科大学出版社，2005:373-379.