柳文菊，杨章元，刘学政，谢良才，王娴默

(长江大学附属第一医院检验科，湖北 荆州 434000)

近年来肺炎支原体(Mycoplasma pneumaniae，MP)所致小儿呼吸道感染呈逐年上升趋势[1]，临床表现也多种多样，不易与其他病原微生物感染相鉴别，因此肺炎支原体感染的实验室诊断就显得尤为重要。用于检测MP感染的实验室诊断方法有MP培养分离、冷凝集试验、MP特异性抗体检测及PCR法等。我们对515例呼吸道感染的患儿样本分别用不同的方法检测并进行比较，以了解不同检测方法对临床诊断的意义，从而为临床医生的诊疗提供可靠和有效的快速检测手段。

1 资料与方法

1.1 标本来源 2010年9月至2011年5月我院儿科门诊及住院部呼吸道感染的患儿515例，男289例，女226例，年龄1个月～13岁。另有非呼吸道感染者100例为对照组，两组性别、年龄差异均无统计学意义。

1.2 试剂 被动颗粒凝集法采用日本富士瑞必欧株式会社生产的赛乐迪亚-麦克Ⅱ(SERODIA-MYCOⅡ)试剂盒；酶联免疫吸附法(ELISA法)由EUROIMMUN医学实验诊断股份公司提供的试剂盒；金标渗滤法试剂盒购自兰波生物技术研究所；PCR采用上海复星医学科技发展有限公司提供的试剂盒；培养法用上海奥普生物医药公司MP专用液体培养基。

1.3 实验方法

1.3.1 冷凝集实验(CAT)血清标本《按中华医学检验全书》“冷凝集测定”进行操作，滴度≥1：64为阳性。

1.3.2 被动颗粒凝集法 血清标本严格按试剂说明书进行操作，当样品与致敏粒子的反应图像判定为(+)或(++)(最终稀释倍数≥1：40)，则结果判定为阳性。

1.3.3 酶联免疫吸附法(ELISA法)血清标本严格按照试剂说明书进行温育、清洗、终止、比色。结果判定以患者与标准品吸光度值的比值≥1.0为阳性。

1.3.4 PCR法 样本处理：咽拭子标本加入l ml无菌生理盐水，充分振荡摇匀漂洗，移入1.5 ml无菌离心管中，13 000 r/min离心10 min，吸取上清液弃去，留取沉淀备用。DNA提取：上述经处理的沉淀标本加入50 μl DNA专用提取液，高速震荡混匀10 s，100℃保温10 min，13 000 r/min。离心10 min备用。荧光PCR定性检测：取4µl DNA提取液，加入26 μl MP-DNA检测体系中在德国产MX3000P仪器中进行检测，50℃预反应2 min；94℃预变性5 min；94℃10 s，60℃40 s，40个循环；阴阳性对照标本同时进行检测。结果判断标准：将结果定义为标本MP-DNA Ct值＜38为阳性。

1.3.5 培养法 在患者入院未用药之前(且近3 d内未用过大环内酯类抗菌素治疗)，取咽拭子培养，严格无菌操作。结果判定：培养液由黄转红为阳性。

1.4 统计学方法 所有数据分析采用SPSS14.0统计软件包处理。分析数据采用χ2检验。

2 结果

2.1 呼吸道感染患儿与非呼吸道感染者检测MP结果 分别对临床诊断为呼吸道感染的患儿与对照组非呼吸道感染的患儿进行MP抗体的检测，515例呼吸道感染组中，阳性111例，阳性率为21.6%；100例非呼吸道感染对照组，阳性6例，阳性率为6.0%，两组阳性率比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 不同实验方法对呼吸道感染患儿MP的检出结果 515例呼吸道感染患儿样本，用培养法检测阳性35例，阳性率为6.8%；用被动颗粒凝集法检测阳性102例，阳性率为19.8%；ELISA法检测阳性95例，阳性率为18.4%；运用冷凝集试验检测阳性40例，阳性率为7.8%；PCR法检测阳性108例，阳性率为21.0%。PCR法与被动颗粒凝集法、ELISA法比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；PCR法与培养法、冷凝集试验比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

肺炎支原体属于柔膜体纲，是一种介于病毒和细菌之间已知最小的非活性生长致病微生物[2]，无细胞壁，最外层为细胞膜，基本形态呈球形或丝形，长2～5 μm，革兰氏染色阴性[3]。人是MP的唯一宿主[4]，儿童和青年多被感染(约40%在5岁以下)[5]。除了原发性非典型性肺炎和常见的呼吸器官感染症状，MP还可以导致一些其他的疾病症状，给患儿健康带来极大的损害。因此实验室诊断显得很有价值。

本次研究结果表明肺炎支原体抗体阳性率在呼吸道感染患儿中有较高的比例，占总病例的21.6%。因此，对呼吸道感染的患儿进行MP的检测是非常必要的。对临床及早找到致病源并确定治疗方案及用药都是很有意义的。培养分离和鉴别MP对诊断和鉴别有决定性意义，是MP鉴定的金标准，但该法要求高，需时长(2～3周)，且检出率较低，在临床上推广应用有困难[6]。

SERODIA-MYCOⅡ凝集试验方法检查肺炎支原体操作简便，敏感性高，能够满足肺炎支原体筛查需要。但该试剂试验仅用于检测肺炎支原体抗体，而非直接检测肺炎支原体。因此阳性结果并不能确诊是MP感染。另外，我们发现有些MP感染的患者，不产生抗体或只产生少量抗体，该方法有时也是不能检测到的，分析可能与个体免疫力差异有关，这就有个假阴性的问题。CAT为临床常用的MP感染辅助诊断指标，但患者病程要达到一周以上才会有阳性结果。而且与其他感染也有一定的交叉反应，缺乏特异性，漏诊率也较高，不能早期、快速诊断，影响及时治疗[7]。

ELISA法检测的MP-IgM在感染一周后产生，3～4周其效价达高峰，但如果是轻度感染仅能刺激局部免疫而不能被检测，另有部分治愈后患者仍有一定强度的抗体滴度，这就不能解决一些假阳性和假阴性问题，从而影响对患者的正确合理的诊疗。PCR法直接检测患者感染的肺炎支原体，能快速反映患者的实时感染情况。且敏感性、特异性都较高，没有交叉反应[8]，用时也不长，一般3 h左右可出结果。同时做好阴阳对照，让检验标准化，给临床提供及时可信的结果。但PCR法也存在对设备和人员要求较高、费用较高的问题。

此次研究结果还表明PCR法检测患儿咽拭子样本与血清学被动颗粒凝集法、ELISA法都有较高的阳性率，分别为21.0%、19.8%、18.4%，且它们之间差异无统计学意义(P＞0.05)。因此，临床医生可根据患儿病情及自身的具体情况灵活选择合适的检测手段，让患儿得到及时明确的诊断，缩短诊疗病程。另从结果中我们还能看出，PCR法、被动颗粒凝集法以及ELISA法对患儿的检出率明显优于培养法及冷凝集试验(P＜0.05)，尽管培养法在MP的确诊上是金标准，但低检出率和耗时长严重地制约了它的发展。同样冷凝集试验的高漏诊率也给临床造成了困扰。

综上所述，要想呼吸道感染患儿能够得到MP的早期诊断，PCR法是个不错的选择。特别是针对年龄较小者，咽拭子的取样简便无创伤，更易被患者接受，为临床制定治疗方案及选择药物提供重要参考。而一周后如果能结合血清学检测中的被动颗粒凝集试验，特别是双份血清检测的提出，对一定程度上提高了MP感染检测的敏感性和特异性，以及明确感染所处时期有非常重要的临床应用价值。

[1]杨晓梅.小儿支原体肺炎肺外表现82例临床分析[J].海南医学，2008,19(5)：87-88.

[2]李俭庆,黄秀丽,贾金荣.阿奇霉素联合红霉素治疗小儿支原体肺炎40例临床观察[J].海南医学,2009,20(8)：60-61.

[3]冯仁丰.实用医学检验学[M].上海：上海科学技术出版社,1996：752-754.

[4]Halbedel S,Stulke J.Tools for the genetic analysis of Mycoplasma[J].Int J Med Microbiol,297(2007)：37-44.

[5]Eun BW,Kim NH,Choi EH,et al.Mycoplasma pneumoniae in Korean children：the epidemiology of pneumonia over an 18-year period[J].J Infect,56(5)：326-331.

[6]Yamazaki T,Narita M,Sasaki N,et al.Comparison of PCR for sputum samples obtained by induced cough and serological tests for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection in children[J].Clin Vaccine Immunol,2006,13(6)：708-710.

[7]高鹏翔.小儿支原体肺炎的早期诊断[J].中国现代药物应用,2009,3(2)：86-87.

[8]孔 梅,周乐全,钟芳华.PCR法检测肺炎支原体的临床应用及结果分析[J].中国实用医药,2009,4(36)：21-22.