裴 勇

(河南中医学院第一附属医院药学部,河南郑州 450000)

消炎止痛洗剂为本院制剂,主要由土茯苓、大黄、芒硝等中药组成,具有清热祛湿、消肿止痛的作用,用于治疗阳证疮疡、便下脓血、痔瘘术后疼痛。本实验采用高效液相色谱法对消炎止痛洗剂中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量进行测定,结果表明,该方法简便可靠,重复性好,可以为质量控制提供参考依据。

1 试药与仪器

消炎止痛洗剂由本院制剂室提供,批准文号为河南省食品药品监督管理局制剂注册批件第2005Z01805号,批号分别 为 100308,100323, 100512。甲醇为色谱纯,水为纯净水。芦荟大黄素对照品批号为110795-200504、大黄酸对照品批号为110757-200206、大黄素对照品批号为110756-200110、大黄酚对照品批号为 110796-200513、大黄素甲醚对照品批号为 110758-200610,均购自中国药物制品检定所。

戴安Ultimate 3000高效液相色谱仪(配Chromeleon工作站,紫外检测器),色谱柱为Alltima C18(250mm×4.6mm,5μm)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Alltima C18(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为甲醇∶0.1%磷酸(85∶15),流速1.0m L/min,检测波长254 nm[1],柱温30℃,进样量:对照品10μL、样品20μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备

精密量取样品5.0mL,加入8%盐酸10mL,超声5min;再加入三氯甲烷15 m L,加热回流1 h,放冷,置分液漏斗中;用少量三氯甲烷洗涤容器,并入分液漏斗中,分取三氯甲烷层;酸液再用三氯甲烷提取3次,每次15m L;合并三氯甲烷液,减压回收溶剂至干;残渣加甲醇使其溶解,转移至10m L容量瓶中;加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得[1]。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚 5种对照品适量,加甲醇分别制成每毫升含芦荟大黄素101.6μg、大黄酸79.6μg、大黄素80.8μg、大黄酚 82μg、大黄素甲醚 40μg的对照品储备液;分别精密量取上述对照品溶液各 2mL,混匀,即得混合对照品溶液Ⅰ(每毫升中含芦荟大黄素20.32μg、大黄酸15.92μg、大黄素16.16μg、大黄酚16.40μg、大黄素甲醚8.0μg)。

分别取芦荟大黄素对照品储备溶液 1.5 m L、大黄酸对照品溶液(浓度为0.496 3 g/L)1.0mL、大黄素对照品储备溶液1.0m L、大黄酚对照品储备溶液2.5 mL、大黄素甲醚对照品储备溶液1.0 mL,置10 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得混合对照品溶液Ⅱ。

2.2.3 阴性对照溶液的制备

依处方比例称取除大黄以外的其余药材,采用消炎止痛洗剂制备工艺制备,按“2.2”项下方法制备阴性对照溶液。将供试品溶液、阴性对照溶液以及混合对照品溶液Ⅰ,分别注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件进行测定。结果,阴性无干扰,见图1。

图1 混合对照品Ⅰ、供试品和阴性对照溶液的HPLC色谱图

2.3 系统适用性试验

取供试品溶液,在上述色谱条件下进样分析,芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚与相邻色谱峰的分离度均大于 1.5。理论塔板数按大黄素计算不低于 3 000。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取上述混合对照品溶液Ⅰ1.0,5.0, 10.0,15.0,20.0μL,按上述色谱条件进行测定。以进样量(μL)为横坐标,峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程分别为芦荟大黄素 Y= 1.631 4X-0.193 4(r=0.999 9),大黄酸Y=1.078 2 X-0.1716(r=0.999 9),大黄素Y=1.231 5X-0.159 4 (r=0.999 9),大黄酚Y=1.366 3X-0.192 2(r= 0.999 9),大黄素甲醚Y=0.429 8X-0.060 8(r= 0.999 9)。结果表明,芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚进样量分别在 0.020～0.406μg、0.016～0.318μg、0.016 2～0.323 0μg、0.016 4～0.328 0μg、0.008～0.160μg范围内时,进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液Ⅰ,按上述色谱条件,重复进样 5次,计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚色谱峰面积的RSD分别为为0.56%、0.85%、0.95%、0.18%、0.32%。

2.6 重复性试验

取同一批号的样品,按“2.2.2”项方法平行制备 5份样品按上述色谱条件进样分析,计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的RSD,分别为 1.35%,0.93%、1.01%、0.98%、1.14%(n=5)。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液,分别于 0,2,4,6,8,12 h注入高效液相色谱仪,依法测定。计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚色谱峰面积的RSD,分别为1.27%、0.89%、1.03%、0.99%、1.22%(n= 6)。结果表明,样品溶液在 12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的供试品3.0 m L(批号100512) 6份,分别加入混合对照品溶液Ⅱ1m L,按上述方法测定分析,结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均回收率分别为 100.34%、99.57%、99.75%、97.24%、98.50%,RSD分别为1.77%、0.64%、0.81%、1.89%、1.91%(n=6)。分别见表 1、表 2、表 3、表 4、表 5。

表1 芦荟大黄素加样回收率试验结果

表2 大黄酸加样回收率试验结果

表3 大黄酚加样回收率试验结果

表4 大黄素加样回收率试验结果

表5 大黄素甲醚加样回收率试验结果

2.9 样品含量测定

取 3批供试品,按“2.2.2”项操作,在上述条件下进样分析,记录色谱峰面积,采用外标一点法计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。结果见表 6。

表6 样品含量测定结果 n=3,mg/m L

3 讨 论

实验色谱条件采用药典方法[2],芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚即达到较好的分离效果,且重复性好。由于样品中蒽醌类成分含量较低,为了减少处理样品时有机溶剂的用量并达到较高的提取率,取样量定为 5m L时,供试品中待测成分含量较低,所以进样量选择 20μL。

测定结果,5种成分中大黄酸远比其他成分含量高。实验前曾考察到该制剂中游离蒽醌类成分的含量,结果,除大黄酸外,其他 4种成分几乎检测不到,这主要与大黄中的 5种游离蒽醌类成分的理化性质有关。游离蒽醌类成分一般不溶于水,而大黄酸可能是因为酸性较强,和某些碱性成分中和成盐而增大了溶解度。

[1]凌明,朱克,王宜祥.高效液相色谱法测定五参安神合剂中大黄素含量[J].中国药业,2008,17(22):37-38.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:化学工业出版社,2010:22.