王 博，许修宏，袁 立

（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）

双孢蘑菇系担子菌亚门伞菌目蘑菇科真菌，作为食用菌栽培已有300多年历史，为世界第一大商业栽培菇种。随着栽培量的逐渐增大，其菌种的生产数量和质量的要求也相应提高。在中国，由于保藏菌种的条件不是很高，菌种的老化问题很严重，直接影响了菌种的质量，双孢蘑菇的产量也受到影响。随着菌龄的增长，菌种的活力等各方面特性都相应下降，即菌丝老化。因而探索出菌丝老化的机理和检测菌丝老化的状态是科研工作和生产实践中迫切需要解决的问题。

真菌的老化问题在近年在国内鲜有研究，在国外主要集中在（Podospora anserina）、（Neurospora）等模式真菌[1-2]，其老化的原因主要与线粒体DNA（mtDNA）改变有关。对双孢蘑菇的营养菌丝老化问题却鲜有研究，有不少学者集中于双孢蘑菇子实体的老化现象的研究。Halit等对老化的菌丝做了形态学观察，得出结论，老化是一个以时间为顺从性的、相对缓慢的变化过程，因此在适当的时间，可以观察出明显的形态学变化[3]。本文对双孢蘑菇的营养菌丝体进行形态学观察并加以分析，为今后鉴别菌种的老化提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株As2796由华中农业大学菌种实验中心提供。

1.2 培养基

一级种采用普通PDA培养基，pH为7.0；二级种采用小麦培养基，含水量45%，混合2%石膏，每瓶装入优质小麦粒200 g，17.65×104Pa高压灭菌2 h[4]。

1.3 供试菌种的培养和形态观察

把等量的一级种接种到小麦培养基中，于24℃恒温培养箱中避光培养，恒温培养箱在使用前彻底消毒，以免培养前期污染杂菌。

分别接种5批，每隔30 d接种一批。选取第一批菌种做形态学观察试验。

挑取少量菌落使用5%结晶紫染色5 min[3]，于1000倍显微镜下观察并拍照记录。

1.4 不同菌龄菌株的活力试验

分别用菌龄30、60、90、120、150、180 d的小麦菌种接种PDA平板中央，观测其萌发时间、长速。作3次重复，取平均值。

1.5 不同菌龄总RNA含量的测算

采用Trizol法提取菌丝的中的总RNA，并用DNAⅠ（Rnase free）进行RNA的纯化，在紫外分光光度计下测出OD值，然后计算含量[5]。重复3次，取平均值。计算出OD260/280的比值，检测RNA的质量；并用1%琼脂糖凝胶电泳对提取的菌丝RNA进行完整性测试[6]。

2 结果与分析

2.1 不同菌龄的观察

当菌龄达到10 d时，菌丝形态均匀，细胞壁光滑，层次单一，单一菌丝细胞之间的连接非常紧密，隔膜间距离较大（见图版Ⅰ-1）。宏观观察菌丝生长至7～8 cm，菌丝生长旺盛，菌势白壮。菌龄达到30 d左右，菌丝形态变化不大（见图版Ⅰ-2），这时菌丝已经长满麦粒培养基。菌龄60 d左右，细胞形态发生较大变化，一部分菌丝形态微微膨胀（见图版Ⅰ-3），尤其在细胞隔膜处较为明显，细胞隔膜间连接不再紧密，类似于竹节状（见图版Ⅰ-4），这个时期此类形态菌丝较多，并且培养基中菌丝吐黄水现象较为严重。菌龄90 d左右，许多菌丝不再是原有的形态，有些细胞壁变得粗糙，不规则，许多菌丝的细胞壁表面附着密集的颗粒状物质（见图版Ⅰ-6）。有些细胞形态粗大，细胞壁呈现出一种肿胀的状态（见图版Ⅰ-5）。菌龄达到120 d左右，越来越多的菌丝细胞壁附着着颗粒状物质（见图版Ⅰ-7），同时存在着严重变形的菌丝细胞，犹如植物细胞液泡（见图版Ⅰ-8），这种细胞在吐黄水的区域较为常见。当菌龄达到150 d左右，菌丝绝大多数已失去原有形态，细胞壁结构几乎消失，形成趋于瓦解形态，但并没有完全消融，仍然保留着丝状形态（见图版Ⅰ-9）。图版Ⅰ-10为放大的单独菌丝，细胞壁外表粗糙，有大量类似于小颗粒状物密集排列，整个细胞形态趋于瓦解。

经观察表明菌丝在培养50～60 d后，菌丝中开始出现细胞胀大、细胞壁变形等现象，并且随着时间的增长这类菌丝的比例越来越大。因此双孢蘑菇菌丝老化时间可能是从接种后的50～60 d开始的。随着菌丝菌龄的增长，老化现象越来越严重。

细胞生物学表明，随着细胞的衰老，菌丝形态发生变化，色素的沉积明显增大，这些现象表明菌丝已经开始老化。这可能是因为丝状真菌细胞的生长集中在细胞顶端，衰老部分不会生长，为生长顶端运送养分，细胞壁较厚；衰老部分新陈代谢分泌的色素逐渐沉积，使菌丝产生黄水。衰老细胞常发生水分减少的现象，结果使细胞收缩，体积缩小，失去了正常的细胞形态，另外生命体的衰老是以总体细胞的衰老为基础的，因此培养基中观察宏观的菌丝呈现出体积减小，塌壁的现象。

图版I 不同菌龄菌丝观察Plate I Observation of mycelium of different spawn age

2.2 不同菌丝菌龄萌发时间和生长速度

使用不同菌龄的菌种分别接种PDA培养基，测量其萌发时间和平均生长速度。菌龄为30 d的小麦粒菌种萌发时间为1.5 d，随着接种的菌龄时间增加，菌丝的萌发时间逐渐变长（见图1），菌龄150 d的菌种萌发时间到达了5 d。老化的菌丝活性较弱，需要更长时间来适应接种后的新环境，因此萌发时间会变长。

图1 不同菌龄对萌发时间的影响（AS2796）Fig.1 Effect of different spawn age on spawn germination time

接种30 d菌龄的小麦粒菌种平均长速最快为1.8 cm·d-1，随着接种菌龄的增加，菌丝的长速逐渐减缓，接种150 d的菌种平均长速为0.96 cm·d-1（见图2）。菌丝的老化细胞的活性降低，生长速度也会受到影响。

2.3 不同菌龄总RNA含量的对比

不同菌龄的菌丝中RNA含量的差异较大，菌龄年轻的菌丝RNA含量较丰富，菌龄30 d的菌丝RNA含量最大，为2231.2 ng·μL-1，菌龄150 d时RNA含量很低，仅为438.9 ng·μL-（1见图3）。这可能是因为此时的菌丝结构和细胞壁的完整性破坏，细胞内RNA降解，另一方面菌丝的老化导致RNA的合成能力降低。

平均菌龄30～150 d的OD260/OD280分别为:1.97、1.87、1.98、1.89、1.81。OD260/OD280均在1.8～2.0之间，因此RNA纯度较高。

1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，除150 d菌丝RNA外，其他菌丝RNA完整性均比较好（见图4）。

图2 不同接种菌龄对菌丝生长速度的影响（AS2790）Fig.2 Effect of different inoculating spawn age on mycelial growth rate

图3 不同菌龄对RNA含量的影响（AS2790）Fig.3 Effect of different spawn age on content of mycelial RNA

图4 总RNA电泳Fig.4 Electrophoresis pattern of total RNA

3 讨 论

生命周期中机体成熟和死亡之间的一个阶段，称之为机体老化。在真菌中为从生长速度开始减缓直到死亡的阶段，这是一个逐渐衰变的的过程[7]，即为真菌的老化。双孢蘑菇的生长周期中分为营养生长和生殖生长，营养生长需要一定条件的刺激才能转换为生殖生长，如果没有刺激，其菌丝就会在基质中一直生长下去，直到衰老死亡为止。本试验菌丝在培养150 d之后菌丝仍然有生长的能力，只是生长活力大大减弱，该现象说明双孢蘑菇菌丝的老化是一个非常缓慢的过程。

蘑菇菌丝的营养生长主要分为三个阶段[8]:第一阶段为缓慢生长期:接种后，菌种对新环境要逐渐适应，所以出现了生长缓慢的现象，时间一般在接种后的一周之内。第二阶段为快速生长期:这时菌丝已经适应培养环境，可生长的菌丝量也很大，因此生长较快。第三阶段为停滞生长期:在快速生长期之后，由于基质中养分的耗尽，氧气的缺乏，代谢产物的积累，使菌丝不能再正常的生长。宏观整体形态上表现为出现大量的色素和菌被，菌丝干缩。在显微形态上表现为出现大量的肿胀变形细胞，一部分细胞出现空包，甚至破裂；同时出现一些细胞壁附着有小颗粒状的菌丝。这是老化的开始，随着时间的推移这类现象会逐渐增加。

菌丝体的生长点在顶端，菌丝的衰老部分是不能生长的。依据丝状真菌顶端生长的泡囊学说，菌丝顶端的泡囊聚集导致了顶端的延伸生长，然而细胞质的流动为泡囊的向顶端的移动提供了一定的驱动力[9]。在菌丝中的细胞质和细胞器一起形成细胞质流，向菌丝的顶端流动，也就是从衰老部分向新生部分流动，这是由于衰老部分逐渐硬化与逐渐扩大的液泡压力，驱使菌丝的原生质从衰老的部位向顶端移动。菌丝的液泡会随着菌龄的增大而增加，随着菌丝的老化，液泡充几乎满了整个细胞，大量的细胞质流被挤向顶端新生部位[10]。然而营养的缺乏会导致菌丝中液泡的生成[11]。随着营养的不断耗尽，细胞液泡变大、细胞壁结构发生改变，导致了细胞分泌物的增多或细胞内含物的流出。这可能是菌龄较大的部位渗出较多黄水的原因，也同样反映了细胞胀大的原因。

菌丝体的细胞壁也同时经历着老化，老化的菌丝的细胞壁要比年轻的细胞壁要厚[12]，并且Katz，Gull等多名学者认为，老化细胞壁和年轻的细胞壁结构组成不同，这种组成结构的不平衡性是老化造成的[13-14]。正是这种不平衡性导致了形态上的差异，造成这种不平衡性的原因主要分为内部和外部原因:内部原因包括细胞器的突变和有毒物质的积累；外部原因包括物理和化学的因素、营养的匮乏、一些酶类对细胞壁的影响。

老化的菌丝由于细胞内部的改变和外部营养匮乏等因素，菌丝的活力明显的下降，接入新的培养基中萌发时间增长，生长速度减缓，菌势也不如菌龄年轻菌丝强。在菌丝生长的不同时期，处于停滞生长期的菌丝对于快速生长期的菌丝，合成RNA和蛋白质的能力产生了不可逆的下降，有些下降15%～20%[15]。这种能力在不同菌龄的菌丝中产生差异，最终导致了较大菌龄菌丝中RNA含量下降。

双孢蘑菇菌丝的老化现象在形态学和生理学、生化学上的关系是显而易见的。但是究竟是菌丝老化过程中生理生化的改变诱发了菌丝的老化，还是环境的改变使菌丝更易于老化，这个问题还有待深入探究。

4 结论

双孢蘑菇菌丝老化开始时间可能是接种后的50～60 d。随着菌丝菌龄的增长，老化现象越来越严重。随着接种菌丝的菌龄增大，菌龄30 d的菌丝对比150 d的菌丝，菌丝的萌发时间从1 d增长至5d；菌丝的生长速度从1.8 cm·d-1降到0.96 cm·d-1；RNA 含量从 2231.2 ng·μL-1下降到438.9 ng·μL-1。

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