克霉唑乳膏微生物限度检查方法学研究＊

2011-03-06

中国药业 2011年12期

(重庆市药品检验所，重庆 401121)

克霉唑乳膏属抗真菌药，临床用于治疗各种皮肤癣、念珠菌性甲沟炎和念珠菌性外阴阴道炎。该药全国现有批准文号8个，涉及6个生产厂家和2个规格，2个规格分别为1%和3%，但市场上抽到的却有几十家生产企业的该药产品。查询国家食品药品监督管理局相关网站数据库资料，发现目前许多上市销售的克霉唑乳膏，根据其批准文号溯源查询，其产品名称均为克霉唑软膏。而克霉唑软膏的批准文号共有98个，因此使得该样品所用基质存在较大差异。为此，笔者对各药品说明书中所列出的辅料进行比较，选出了几个有代表性的样品，并对其微生物限度检查方法学进行了研究，现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 样品与培养基

克霉唑乳膏:江西杏林白马药业有限公司(规格为1%，批号为20071201);新乡市琦宁药业有限公司(规格为1%，批号为20080301，20080305);广东顺峰药业有限公司(规格为3%，批号为20080101);重庆科瑞制药有限责任公司(规格为3%，批号为070909);北京双吉制药有限公司(规格为3%，批号为080454);青岛国风维奥制药有限公司(规格为3%，批号为080201);杨凌生物医药科技股份有限公司(规格为3%，批号为20080101);天津药业集团有限公司(规格为1%，批号为0802032)。共8个厂家9个批次的样品。营养肉汤培养基(批号为080710)、营养琼脂培养基(批号为080821)、改良马丁培养基(批号为080617)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号为080626)、卵黄氯化钠琼脂培养基(批号为080716)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号为080919)、胆盐乳糖培养基(批号为090203)、十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号为081021)，均由中国药品生物制品检定所提供。

1.2 试验菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均由中国药品生物制品检定所提供。

1.3 仪器

全封闭薄膜过滤器，由杭州泰林生物技术设备有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养24 h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养48 h上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数小于100 CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养7 d，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含孢子数小于100 CFU的孢子悬液。菌悬液每次试验前新鲜配制，备用。

2.2 细菌、霉菌和酵母菌检查方法学考察

2.2.1 普通直接接种法

首先采用pH=7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液将克霉唑乳膏分散后，制成1∶10的供试液;取供试液1 mL和2.1项下制备的试验菌菌悬液1 mL，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备两皿，按平皿法测定其菌数;另同法测定所加的试验菌数。结果菌回收率金黄色葡萄球菌为38%，大肠埃希菌为55%，枯草芽孢杆菌为23%，白色念珠菌为0，黑曲霉为1%，说明克霉唑乳膏对细菌、霉菌和酵母菌均有一定的抑制作用。

2.2.2 培养基稀释法

根据2.2.1项的试验结果对试验方法进行了调整，采用培养基稀释法进行试验。每1 mL供试液(1∶10稀释液)等量分注5皿，每皿加供试液0.2 mL，进行回收率试验。结果菌回收率金黄色葡萄球菌为65%，大肠埃希菌为73%，枯草杆菌为48%，白色念珠菌为2%、黑曲霉为10%，说明培养基稀释法能够较好地去除克霉唑乳膏对大肠埃希菌的抑菌作用，但对其他菌仍有一定的抑菌作用。

2.2.3 薄膜过滤法

稀释液选择:由于培养基稀释法不能很好地去除样品的抑菌作用，故决定采用薄膜过滤法对样品进行处理后进行细菌、霉菌和酵母菌计数检查。因薄膜过滤法需考虑样品在稀释剂中的分散效果以及过滤情况，故对其分散剂进行了系统考察。分别选择pH=7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液、十四烷酸异丙酯作为稀释剂，以及先加入吐温80乳化后再加入缓冲液分散的方法进行试验。结果样品于十四烷酸异丙酯中不能分散，加吐温80进行乳化后分散效果改善不明显，意义不大。经摸索比较，最终确定的样品分散方法为，取克霉唑乳膏10 g，加恒温(45℃)的pH=7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100 mL

冲洗量选择:由于克霉唑不溶于水，为考察样品过滤后克霉唑是否还对霉菌及酵母菌计数产生影响，先取样品10 g，加恒温至45℃的pH=7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100 mL，直接过滤而不进行冲洗，以白色念珠菌作为试验菌并延长观察时间。结果样品阳性组生长较阳性对照组缓慢，但在第5天回收率可达38%，较其他方法回收率有明显提高，显示薄膜过滤应该能去除样品中克霉唑的影响，若进行冲洗，则能更好地去除样品中克霉唑的影响。分别采用200，500，800 mL的冲洗量对各阳性试验菌的回收率进行测定，结果见表1。

表1 薄膜过滤法冲洗量选择回收率试验结果

试验结果:以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉作为试验菌，对薄膜过滤后冲洗800 mL的方法进行了确认试验。结果试验菌回收率金黄色葡萄球菌为82%，大肠埃希菌为88%，枯草芽孢杆菌79%，白色念珠菌80%，黑曲霉87%，回收率均大于70%，符合药典相关要求。

2.3 控制菌检查方法学考察

采用常规方法，直接将供试液10 mL加入100 mL增菌培养基中，以金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌作为阳性菌，大肠埃希菌为阴性对照菌，依法进行检查。结果加入样品后的金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌均于48～72 h方可检出，阳性对照菌于24 h生长良好，阴性对照菌未检出大肠埃希菌，显示样品对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌有轻微的抑菌作用。

采用培养基稀释法，每10 mL(1∶10)供试液加入不少于200 mL培养基中，金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌均于24 h内检出，阳性对照菌于24 h生长良好，阴性菌对照组未检出大肠埃希菌。因此，该方法能够去除样品中的抑菌物质对控制菌检查的影响。

2.4 方法确认

由于各生产厂家的产品处方工艺均存在一定的差别，故采用8个厂家各1批样品对2.2项和2.3项下确定的方法进行了确认，细菌、霉菌和酵母菌计数采用将供试液薄膜过滤、冲洗800 mL的方法进行检查。结果表2。可见，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率均大于70%。

表2 各生产厂家产品细菌、霉菌和酵母菌回收率试验结果(%)

控制菌检查采用培养基稀释法，每10 mL(1∶10)供试液加入不少于200 mL的增菌培养基中，结果8个生产厂家的样品试验组金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌均于24 h内检出，阴性菌对照组均未长菌。

2.5 样品微生物限度检查方法

取本品10 g，加恒温至45℃的pH=7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100 mL，均匀分散后，制成1∶10的供试液。取1 mL供试液，薄膜过滤，再用800 mL pH=7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液分次冲洗滤膜，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养，进行细菌、霉菌和酵母菌数计数检查;另取10 mL供试液，加入不少于200 mL的亚碲酸钠(钾)肉汤(或营养肉汤)培养基和胆盐乳糖培养基中，依法[1]进行金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的控制菌检查，应符合规定。