蔡真，李寅

中国科学院微生物研究所，北京 100101

进入 21世纪以来，矿石资源和能源的不断减少、环境污染的日益严重，给传统的化石经济带来了巨大冲击，各国均在探索新的社会和经济的可持续发展模式。在此背景下，工业生物技术因其资源可再生、环境友好、过程简单且高效专一等特点，一经提出便备受关注，被普遍认为是可以解决人类目前面临的资源、能源及环境危机的有效手段。为此，美国、日本和欧洲的一些发达国家已制定了在今后几十年中用生物过程逐步取代化学过程的战略计划。针对我国经济高速发展、人均资源严重短缺、环境污染非常严重的具体国情，大力发展工业生物技术，更是实现我国社会可持续发展的重要途径之一。

工业生物技术从提出至今不过十多年的时间，但发展却非常迅速。就全球而言，现代生物技术已经渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域，并扮演着极为重要的角色。生物技术在环境、材料、信息等领域的应用也在不断扩大和加强。我国工业生物技术科技和产业发展迅速，部分产业的规模在世界上已占有举足轻重的地位。然而技术水平低、市场竞争力弱仍是制约我国工业生物技术产业发展的瓶颈问题。在这样的背景下，《生物工程学报》策划并组织出版本期“工业生物技术”专刊，集中介绍国内该领域专家学者在基因工程、代谢工程与合成生物学、生理工程、发酵工程与生化工程、生物催化与生物转化等方面的最新研究成果。

在基因工程研究领域中，开发新功能的酶/活性多肽、提高蛋白质的异源表达量、酶编码基因的鉴定及酶活性的快速检测等依然是研究热点和重点。江南大学陈卫等[1]通过基因搜索工具筛选出一种新的 IIa类细菌素，并通过融合表达实现了该细菌素在大肠杆菌中的高效可溶表达。为了实现目标蛋白在毕赤酵母中的规模化制备，江南大学许正宏等[2]用双质粒共表达体系将一种潜在的糖尿病治疗药物——人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达量提高了 50%。值得一提的是，研究者还开发了利用硝酸纤维素膜固定菌落分泌的蛋白，再利用将滤膜与抗体杂交显色的免疫斑点法，可以同时筛选几百个转化子中目标蛋白的表达量，提高了筛选的效率和准确度，为其他类似研究提供了借鉴。河北大学张利平等[3]用重叠延伸PCR的方法获得三孢布拉霉CarRA蛋白的编码基因，并在大肠杆菌体内构建了该酶的活性检测方法，可以通过颜色互补，方便快速地检测出该酶的番茄红素环化酶功能活性和八氢番茄红素合成酶功能活性。

发酵工业是工业生物技术的核心产业。目前，已有超过500种产品 (覆盖50个行业) 是通过大规模的微生物发酵生产的[4]。目前我国发酵工业正以每年20%的速度快速发展，预计到2015年，我国发酵工业产值将超过1万亿人民币。针对不同发酵产品，许多研究者分别从代谢工程、合成生物学、生理工程、发酵工程、生化工程等角度，开展了创新的研究工作。

在代谢工程方面，宿主中目标产物代谢途径中还原力NAD(H) 或NADP(H) 的不平衡问题，严重制约了目标产物的大量生产。为了解决此问题，中国科学院微生物研究所李寅和周杰等[5]阻断了蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803中聚羟基丁酸酯PHB合酶编码基因，在不影响细胞生长的情况下，减少了副产物PHB的合成，提高了细胞内NADPH的水平，构建了一个改变碳流向并具有充足还原力的工程蓝藻，为蓝藻产化学品奠定了基础。南京工业大学姜岷等[6]则针对大肠杆菌利用葡萄糖生产丁二酸时NADH的供给问题，在宿主中过量表达依赖NAD+的苹果酸脱氢酶，使重组菌恢复了厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。同时为了减少副产物形成，研究者还敲除了大肠杆菌中乳酸脱氢酶和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因，阻断了丁二酸合成的代谢支路。最终采取两阶段发酵时，丁二酸浓度和得率分别达到15 g/L和1 g/g葡萄糖，生产强度为1 g/(L·h)。

除了改变代谢途径中还原力不平衡的问题以外，提高代谢途径中限速酶的表达量也是加强整个代谢途径、提高目标产量的有力方法。在这一方面，江南大学饶志明和许正宏等[7]，在研究来源于钝齿棒杆菌的 N-乙酰鸟氨酸转氨酶的酶学性质的基础上，在钝齿棒杆菌中过表达该基因，将其精氨酸产量提高了15%。另外，在非天然宿主中构建目标产物代谢途径以及加强天然宿主利用非天然底物的能力这两个方面也取得了一定的进展。江南大学石贵阳和张梁等[8]从自然样品中筛选分离得到一株能在pH 2.5 (乳酸调节) 的培养基中生长且不利用乳酸的酵母，通过在其中表达来源于米根霉 As3.819的乳酸脱氢酶编码基因并初步优化其培养条件，可使乳酸产量达到40 g/L以上。大连理工大学袁文杰和白凤武等[9]，从马克斯克鲁维酵母中扩增出菊粉酶编码基因，并导入酿酒酵母工业菌株中，以200 g/L粗菊芋粉生料进行乙醇发酵时，重组菌株的发酵终点乙醇浓度可达55 g/L，糖醇转化率为0.495，达到理论值的 96.9%，为非粮作物菊芋生产燃料乙醇奠定了良好基础。

始于 21世纪初的合成生物学的核心是通过设计和构建自然界中不存在的人工生物系统，来解决能源、材料、健康和环保等问题。主要技术包括DNA的合成，来自多种微生物中基因及代谢途径的组装，多基因的精密调控等。为了构建抗疟疾药青蒿素前体——紫穗槐-4,11-二烯的人工合成途径，军事医学科学院方宏清等[10]在大肠杆菌中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因，利用大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸，成功获得了紫穗槐-4,11-二烯。另外，还通过引入粪肠球菌的甲羟戊酸途径来增加前体供给，并过表达代谢途径中3个限速酶，最终使摇瓶中紫穗槐-4,11-二烯产量达到235 mg/L，为高效合成紫穗槐-4,11-二烯奠定了基础。

以上代谢工程和合成生物学均是以提高目标产物产量为主要目标。但是要想实现实际的工业应用，除了提高目标产物的合成能力外，菌株的工业适应性 (包括抵抗生产过程中pH、温度、渗透压等环境条件的波动，对产物或底物抑制不敏感，菌株在发酵过程中的稳定性等) 也同样非常重要，生理工程的概念应运而生[11]。为了提高工业酿酒酵母在乙醇发酵中抗温度胁迫的能力，中国科学院微生物研究所何秀萍和张博润等[12]先用传统的化学诱变剂(硫酸二乙酯) 处理酵母细胞，再提取优势突变株的DNA，经上述诱变剂处理后重新导入亲本细胞，最终获得重组菌株的最高生长温度比原始菌株提高了3 ℃，在30 ℃~40 ℃范围内具有良好的糖醇转化率和乙醇产量，发酵200 g/L葡萄糖能够产生83.8~91.2 g/L乙醇。这一结合了化学诱变和基因组DNA诱变的方法，也可为改造其他宿主的其他生理功能提供借鉴思路。

除了前述基因工程、代谢工程、合成生物学、生理工程这些工业生物技术的上游研究以外，针对发酵产品的发酵工程以及针对酶的生化工程这类中、下游研究同样重要。在发酵工程方面，江南大学吴敬等[13]优化了大肠杆菌表达嗜热子囊菌角质酶的发酵条件，最终使3 L发酵罐中角质酶酶活达到 506 U/mL，是迄今国内外报道细菌来源角质酶的最高水平。集美大学蔡慧农等[14]优化了7 L罐中法夫酵母产虾青素的pH值调控方式及补料培养基成分对发酵的影响，最终在 1 m3罐中试补料发酵时，虾青素和总类胡萝卜素的体积产率分别达到279.96 mg/L和618.01 mg/L。而在生化工程方面，四川大学廖学品等[15]用三价铁改性胶原纤维，在固定过氧化氢酶时表现出了优良的固定化载体性能。

生物催化与生物转化是用具有催化能力的全细胞或酶将原料转化为目标产品，被 经济合作与发展组织 (OECD) 定位为构建和环境协调的产业体系的关键技术。在这一方面，江南大学石贵阳等[16]在枯草芽胞杆菌中表达羰基还原酶，实现了用全细胞催化底物 1-苯基-2-甲氨基丙酮生成 d-伪麻黄碱。由于该酶促反应需要NADH，所以研究者把该反应置于枯草芽胞杆菌中进行，并利用细胞内源的葡萄糖脱氢酶完成辅酶再生。最终在葡萄糖存在的情况下，该重组枯草芽胞杆菌生成d-伪麻黄碱的产量为97.5 mg/L，底物摩尔转化率为24.1%。为了研究温度在β-1,3-葡聚糖酶分解酵母β-葡聚糖时的作用，山东大学卢雪梅等[17]采用分体模块设计，研制了一种新型的温度梯度产生装置，可以快速、精准、连续地实现多个温度的控制。研究结果不但能为寡糖生产提供精确的温度控制参数，也为其他需要精确连续控温的实验提供了方便。通过分子定向进化，改善和提高酶的性能，一直是这一领域的研究热点。暨南大学姚冬生等[18]采用易错PCR的方法，获得了耐高温和在酸、碱条件下均稳定的黄曲霉毒素解毒酶突变体，为提高体外直接降解黄曲霉毒素的效率奠定了基础。

最后，在生物技术与方法方面，卫生部抗生素生物工程重点实验室武临专等[19]开发了一种快速检测抗生素洋橄榄叶素的化学方法，主要包括TLC硅胶板分离、NaOH溶液显色、HPLC和LC-MS分析。同时，还可以利用该抗生素生物合成基因簇中的tgd基因的PCR检测与序列分析，对该抗生素的生产菌进行快速检测。

希望本期专刊能为国内从事相关领域的研究者提供借鉴和参考，促进我国工业生物技术进一步发展。

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