赵 璇 郭常辉

(重庆医科大学附属第二医院内分泌科，重庆 400010)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，临床上一旦发生，肾脏损害常呈不可逆进展，透析病人中DN患者占20% ～40%〔1〕，故DN的早期诊断及治疗对于改善患者生活质量及预后具有重要的临床意义。DN的发病机制尚未明了，大量研究表明氧化应激在DN的发病机制中发挥了重要作用。硫氧还蛋白(Trx)及Trx相互作用蛋白(TxnIP)分别参与了氧化应激的对抗及介导。本文就Trx、TxnIP、氧化应激与DN关系做一探讨，旨在为DN的发病机制及治疗寻求新的突破。

1 Trx

1.1 Trx的生物学特点 Trx是一种小分子蛋白质，分子量约为12 kD，广泛存在于原核、真核生物中，具有氧化还原活性。它与Trx还原酶(TrxR或TR)、还原型烟酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)共同组成一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化物还原酶-Trx系统。该系统都包含有二硫键活性位点序列-半胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-(-Cys-Gly-Pro-Cys-)。Trx主要分为Trx-1和Trx-2两型，Trx-l存在于细胞质和细胞核中，Trx-2仅位于线粒体中。Powis等〔2〕通过Western印迹法证实了Trx-2的线粒体定位。目前对Trx-2功能知之甚少，本文中Trx指的是Trx-1。还原型Trx〔Trx-(SH)2〕含有巯基，氧化型Trx(Trx-S2)含有二硫键，后者可被TrxR、NADPH还原。Trx还原作用的机制在于其与底物X-S2结合后，在复合物的疏水环境中，Cys32的巯基作为亲核物质，与蛋白底物结合形成共价键的二硫化物，最后去质子的Cys35作用于此二硫化物的二硫键，释放出被还原的蛋白底物。

1.2 Trx的生物学功能 Trx的主要生物学功能在于调节细胞内氧化还原状态，对抗氧化应激。Trx通过多种机制对抗氧化应激，其中主要包括两个方面〔3〕。一方面，它作为电子载体，为生物合成的催化循环及抗氧化酶类提供氧化还原当量，如核糖核苷酸还原酶，蛋氨酸亚砜还原酶，及过氧化还原蛋白;另一方面，通过细胞内及细胞间的二硫化物的形成，Trx保护细胞质内的蛋白分子防止其聚合或者失活。

另外，Trx的还原形式可抑制凋亡信号调节激酶1(ASK1)的活性，从而抑制ASK1依赖性的凋亡〔4〕。ASK1可激活P38MAP激酶和c-Jun N-端激酶(JNK)通道，是肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导凋亡所必需的分子物质。Trx还具有维持细胞内环境的稳定、修护再灌注损伤、抑癌及细胞因子样作用。

2 TxnIP

TxnIP〔又称维生素D3上调蛋白1(VDUP-1)或Trx结合蛋白2(TBP-2)〕，重约50 kD，与抑制类蛋白具有同源性。人们最初在用1，25-二羟维生素D3治疗的白血病细胞(HL-60)中发现了TxnIP。此后，人们用酵母双杂交系统分离了TxnIP，并认为它是Trx结合蛋白，对Trx功能及表达具有负性调节作用，通过抑制Trx系统的功能而发挥介导氧化应激等作用。Patwari等〔5〕证明了TxnIP与Trx通过巯基交换形成稳定的二硫键复合物而发生相互作用，并发现了2个对此相互作用十分重要的氨基酸基团-TxnIP63和247位半胱氨酸残基。

3 TRX和TxnIP与DN的关系

3.1 氧化应激在DN的发展中起了重要作用 近年来研究表明氧化应激在DN的发病机制中起了重要作用。Hamada等〔6〕通过实验发现糖尿病内环境下肾脏中氧化应激标志物8-脱羟鸟苷(8-OHdG)及acrolein adduct明显增多，提示氧化应激参与了DN的发生发展。多种机制可诱导细胞内外的氧化应激，包括糖化反应，多元醇途径，蛋白激酶C依赖的膜性NADPH氧化酶的活化，及线粒体内的电子传递，它们介导了不同组织器官细胞功能的紊乱，如肾小球系膜细胞及内皮细胞。为了对抗氧化应激，细胞拥有其自身防御机制如内源性抗氧化剂。在细胞质中，Trx系统及谷胱甘肽/谷氧还蛋白(GSH/GRX)系统对于维持细胞内氧化还原状态的平衡起了主导作用〔3〕，它们可减少细胞内活性氧(ROS)的产生。已知ROS是细胞内级联反应调节剂，过多的ROS的产生会导致氧化应激、细胞功能的丧失、甚至细胞的凋亡，且ROS的过多产生与抗氧化应激之间的失衡会导致肾小球系膜细胞脂质代谢的紊乱，引起肾小球系膜细胞的损害〔7〕。

3.2 Trx及TxnIP在肾脏中的定位与表达 Dutta等〔8〕对健康小鼠的肾脏进行Western印迹法分析，结果发现:在肾脏近曲小管细胞中，TxnIP主要分布于细胞核及线粒体中，少量分布于细胞质中，在微粒体中几乎没有分布。电镜下进一步发现，TxnIP存在于肾脏近曲小管细胞的线粒体及细胞核的膜间隙中。Andvani等〔9〕通过实验研究链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病雌性转基因R(TGR，mRen-2)27大鼠及DN患者肾脏中TxnIP与Trx的表达及定位。他们利用定量逆转录多聚酶链反应(QRT-PCR)技术，发现TxnIPmRNA在糖尿病鼠中的表达较健康对照组增多，Trx在糖尿病鼠与非糖尿病鼠中的表达却无明显区别;进一步研究发现，TxnIP mRNA在大鼠肾脏的肾小管及远端肾单位中有大量表达，且TxnIP蛋白的分布与TxnIPmRNA相似;他们在DN患者中得到了与前面所述相同的结果。与TxnIP相比，大鼠肾脏中Trx基因的表达多局限于皮质，内侧带多于外侧带，并在皮质所有结构中均有表达。

3.3 TxnIP与DN 有研究称〔10〕，高糖环境下TxnIP的表达依赖于转化生长因子-β1(TGF-β1)对其的上调作用，目前认为TGF-β1为细胞因子网络的核心，参与了DN肾脏肥大和硬化的发生、发展。然而Qi等〔11〕在高糖环境下培养人类肾脏近曲小管细胞，他们用小分子干扰RNA(siRNA)将TGF-β1基因沉默，发现高糖环境下在TGF-β1基因沉默的近曲小管细胞中，TxnIP及其启动子的活性仍进一步升高，证明高糖环境诱导TxnIP的升高并非依赖于TGF-β1。

为了探讨高糖对肾脏三种不同类型细胞-肾小球系膜(mesangial)细胞、近曲小管细胞及远曲小管/集合管细胞 TxnIP及Trx基因表达的影响。Advani等〔9〕将三种细胞置于25 mmol/L糖水中培养48 h，与暴露于5.6 mmol/L的糖水中的细胞相比，TxnIP在肾小球近曲小管、远曲小管及集合管细胞中的表达明显增加，Trx mRNA在肾小球系膜细胞及远曲小管/集合管细胞中表达下降，在近曲小管细胞中无明显影响;胰岛素二硫化物还原分析显示，暴露于高糖环境下48 h后Trx的生物活性下降了;他们又用siRNA沉默TxnIP基因，培养肾小球系膜细胞及近曲小管细胞，发现该环境下高糖对Trx活性的影响减弱了。此实验揭示了高糖对三种细胞TxnIP及Trx基因表达的影响，进一步证明了TxnIP是Trx活性的负性调节剂。

有研究提示肾小球系膜细胞的病理改变在DN的进展中起关键作用。持续的TxnIP超表达可增加高糖及葡糖胺介导的肾小球系膜外基质基因表达及氧化应激，引起肾小球系膜细胞的损害，促进DN的进展。Kobayashi等〔12〕通过实验发现了TxnIP可导致胶原蛋白在肾小球系膜细胞的沉积。肠促胰岛素肽(EX-4)为长效的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，可以降低TxnIP在胰岛β细胞中的水平;Shao等〔13〕研究表明EX-4-cAMP信号通路可导致蛋白酶体依赖性的TxnIP降解，保护DN患者胰岛β细胞，促进胰岛素分泌，降低其血糖水平，改善肾脏所处的内环境。

Hamada等〔6〕利用STZ诱导的糖尿病大鼠来研究TxnIP在DN发病机制中可能存在的作用。为了评估实验组与健康对照组大鼠肾脏中氧化应激程度的差别，他们利用酶联免疫分析方法检测大鼠肾脏中氧化应激标志物8-OHdG与acrolein adduct的水平，结果显示，与对照组相比，实验组中两种标志物明显升高;利用QRT-PCR分析发现，实验组大鼠肾脏中TxnIP mRNA的表达也高于对照组。既然TxnIP可以与Trx相互作用，该实验证明了糖尿病内环境促进了TxnIP与Trx的相互作用，抑制Trx的抗氧化应激功能，引起细胞内氧化应激水平的增加，提示TxnIP可能是糖尿病内环境下氧化应激保持高水平的机制。

3.4 Trx超表达抑制DN的进展 近年来研究证实凋亡可导致自身免疫性及药物性糖尿病胰岛β细胞的损害，ROS的细胞毒性可损害1型糖尿病患者的胰岛β细胞。Hotta等〔14〕通过实验证实Trx可保护胰岛β细胞，减少凋亡与氧化应激对它的损害;Trx在胰腺细胞中的超表达可减少1型糖尿病的发生。

Hamada等〔15〕对8 w大的雄性Trx转基因鼠(Trx-Tg)与野生型同窝鼠(WT)分别给予链脲佐菌素或柠檬酸盐载体喂养。24 w后，通过对四组小鼠血液及尿液的生化分析及肾脏的组织学分析，来评估氧化应激与糖尿病肾病的肾脏损害程度。结果显示:糖化血红蛋白(HbA1c)水平在糖尿病Trx-Tg与糖尿病WT之间并无显著差别;而糖尿病Trx-Tg中尿蛋白的排泄却明显低于糖尿病WT;与糖尿病WT相比，糖尿病Trx-Tg中TGF-β的表达显著下降，肾小球系膜基质膨胀和肾小管损伤均被抑制;同时，糖尿病Trx-Tg尿中氧化应激标志物8-OHdG与acrolein adduct的排泄低于对照组，且它们在肾脏中的免疫染色强度也弱于糖尿病WT，通过Trx的超标达全身及肾脏的氧化应激减弱了。这个实验提示氧化应激与DN进展的相关性以及Trx抑制DN进展的潜在可能性。

4 展望

作为内源性氧化应激抑制剂，Trx的超标可能对于DN的进展具有抑制作用。最新研究显示，Trx可保护视网膜神经节细胞免受药物诱导的氧化应激损害〔16〕，同时Trx的超标达可通过抑制应激诱导的凋亡，对糖尿病鼠的胚胎具有保护作用〔17〕。相反，TxnIP的过度表达介导了氧化应激，造成相应组织器官的损害。Trx、TxnIP、氧化应激与DN之间关系的研究为DN的发病机制及治疗提供了一个新思路，沉默TxnIP基因、开发TxnIP抑制剂或Trx激动剂可能成为未来DN治疗中新的切入点。

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