王祥财,廖长风,张庭龙,梁 艳,李海亮,黄 莉,刘礼平,许明君,李树芳

(江西赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000;1.血液肿瘤科;2.血液病实验室）

Real Time PCR(CR-T PCR）是近年研制出的一种核酸定量技术,定量范围在0-1013基因拷贝/L,在检测微小残留病灶较其他方法精确、简捷[1],尤其适合于bcr/abl阳性白血病,诊断慢性粒细胞白血病(CML）疗效观察、预后判断等动态监测,我们采用荧光定量Real Time PCR反应技术检测39例CML及其它血液性疾病20例的bcr/abl融合基因表达水平,并对其结果进行探讨分析,现报导如下。

1 材料与方法

1.1 对象

1.1.1 选择2006-2009年我院门诊及住院的慢性粒细胞白血病患者39例,其中男性24例,女性15例,年龄最小16岁,年龄最大 79岁,平均年龄40.6岁,所有病例均按血液病诊断标准[2]明确诊断,其中加速期9例,急变期2例,慢性期28例。

1.1.2 选择同期诊断的各种血液病患者20例作为对照,其中真性红细胞增多症3例,原发性血小板增多症1例,急性粒细胞白血病2例,特发性血小板减少性紫癜5例、缺铁性贫血5例,巨幼细胞性贫血4例。

1.2 方法

1.2.1 提取 取新鲜外周血5 ml或骨髓血2 ml,肝素抗凝,加入等体积生理盐水稀释,经淋巴细胞分离液(Ficoll,相对密度1.077）分离,1 500 r/min离心10 min,取界面层单个核细胞(MNC）,PBS洗涤 1-2次。

采用TRIZOL(Gibco-BRL）一步法提取RNA,紫外线分光光度计测定260-280 nm波长处的吸光度值,并计算RNA含量。-20℃保存。

1.2.2 引物及探针设计、合成bcr/abl融合基因,上游引物(CML-A）:5′-CTTCTCCCTGGCATCCGTGGA-3′;下游引物(CML-B）:5′-TGCAACGAAAAGGTTGGGGT-3′,分别设计在两个基因的exon 2,防止漏检。按照Real Time PCR探针设计要求,CML探针(CML-C）:5′-TTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCC-3′,其中在 5′端标记上荧光发光基团FAM,3′端标记上荧光淬灭基团TAMRA。上述引物及探针均由上海Sangon生物工程公司合成。……