张赛，邢克克，胡亚冬，谢春芳，刘大岭，姚冬生,3

1 暨南大学 微生物技术研究所，广州 510632

2 广东省生物工程药物重点实验室，广州 510632

3 基因工程药物国家工程研究中心，广州 510632

黄曲霉毒素 (Aflatoxin，AFT) 是由黄曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和溜曲霉等多种真菌产生的次级代谢产物[1-2]，其中黄曲霉毒素B1 (AFB1) 分布范围最广且化学性质最稳定[3]，具有很强的致癌性、致突变性和致畸性。文献报道氧化还原酶是一类对AFB1有分解转化作用的酶。Doyle等[4]报道寄生曲霉Aspergillus parasiticus能够产生降解AFB1的过氧化物酶 (Peroxidase)，过氧化物酶的量与AFB1被降解的量之间存在着直接的关系。Ueng等[5]报道细菌重组表达的人细胞色素 P450 酶 (Bacterial recombinant human cytochrome P450) 1A2转化黄曲霉毒素 B1所形成的产物的基因毒性比 P450酶3A4低。Das等[6-7]报道辣根过氧化物酶 (Horse radish peroxidas) 在20 ℃、pH 6.0处理黄曲霉毒素B1 60 min，转化黄曲霉毒素B1的效率达到38%。Alberts等[8]报道变色栓菌Trametesversicolor的真菌漆酶 (Fungal laccase) 在 30 ℃、pH 6.5处理1.4 μg/mL的黄曲霉毒素B1，72 h后的降解率可达87.34%。黄曲霉毒素解毒酶 (Aflatoxin detoxifizyme，ADTZ) 是一种来自发光假蜜环菌 Armillariella tabescens E-20，能够在体外直接降解黄曲霉毒素，使其特征荧光吸收明显减弱的氧化酶。但是该酶在高温和极端pH条件下稳定性差，易丧失活性[9]，限制了其在工业上的应用。为了获得更高催化效率的酶，加速其在工业生产上的应用进程，采用定向进化(易错 PCR) 的方法，向该酶中随机引入突变，建立黄曲霉毒素解毒酶基因突变文库，再结合HRP-RBG快速高通量筛选系统筛选的方法，获得了催化效率提高的黄曲霉毒素解毒酶突变株。

酶的改造可以分为理性设计和非理性设计，前者通过分析蛋白质三维结构，确定结构与功能之间的关系，再通过定点诱变改变蛋白质中个别氨基酸，产生新性状的蛋白质；后者不需要了解蛋白质结构和功能关系，在实验室中模仿自然进化的过程——随机突变、重组和选择，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效地改造蛋白质[10]。利用易错PCR (Error prone PCR) 或 DNA改组 (DNA shuffling)对酶分子编码基因进行定向进化，可获得催化效率提高的酶蛋白，并改善酶的一系列性质，如稳定性[11-12]、底物特异性[13]等，是蛋白质工程的重要研究工具。由于对黄曲霉毒素解毒酶的空间结构与功能的关系尚不了解，所以采用非理性的方法 (易错PCR技术) 进行改造。利用黄曲霉毒解毒酶催化黄曲霉毒素 B1时产生的 H2O2[14]与辣根过氧化物酶(HRP)-隐性亮绿 (Recessive brilliant green，RBG) 系统关联，使隐性亮绿 (RGB) 转化成亮绿 (Brilliant green，BG)，通过简单检测反应物吸光值变化对突变体进行鉴定，并用实验室构建的酿酒酵母附加型分泌表达载体构成了一个突变酶的快速筛选系统，实现了对所建的突变库进行高通量筛选，解决了筛选时大量检测黄曲霉毒素繁杂耗时和高成本的问题，并达到了良好的筛选目的。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

宿主菌酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae BJ5465购自Invitrogen公司；大肠杆菌DH5α由本研究室保存；大肠杆菌-酿酒酵母穿梭分泌表达质粒pYES2/CT/α-factor (简写为pYCα) 系本实验室自行构建[15]；pKLAC1-adtz重组质粒为本研究室保存。

1.2 酶和试剂

PCR所用试剂为NEB公司产品；限制内切酶酶XhoⅠ和NotⅠ为TOYOBO公司产品；小量质粒抽提试剂盒和 PCR产物快速胶回收试剂盒购自TIANGEN公司；酵母质粒抽提试剂盒购自Biomega公司；PCR引物合成和DNA测序委托北京奥科生物技术公司；辣根过氧化酶和亮绿购自上海生工生物工程技术服务有限公司；AFB1和二甲基亚砜(DMSO) 购自Sigma公司；其他试剂为国产分析纯。

1.3 培养基

培养基 LB、YPD、YPGal、SC-U-D均按《Invitrogen公司操作手册》推荐方法配制。

1.4 易错PCR的扩增与突变文库的建立

1.4.1 易错PCR引物设计

根据已知adtz基因序列，使用Primer Premier 5.0软件设计error-prone PCR引物。在引物的末端分别引入限制内切酶XhoⅠ和NotⅠ的酶切位点 (下划线所示)，并分别在5′端增加3~5个保护碱基。上游引物P9A1:5′-CCCTCGAG AAAAGAGAGGCTGAAGC TATGGCCACCACAACTGTCC-3′；下游引物P9A2: 5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGC TTACAATCGTCTC TCAATGAAACTTTC-3′。

1.4.2 易错PCR反应体系

20 μL反应体系为：10×PCR缓冲液2 μL，dATP (10 mmol/L) 和dGTP (10 mmol/L) 各0.4 μL，dCTP (10 mmol/L) 和dTTP (10 mmol/L) 各2 μL，模板pKLAC1-adtz 0.2 μL，上下游引物 (10 μmol/L) 各0.6 μL，MgCl2(25 mmol/L) 4.4 μL，MnCl2(2 mmol/L) 0、0.8、2、4、6、8 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL， ddH2O 8、6、4、2、0.8、0 μL。易错PCR 循环程序：降落PCR，94 ℃ 5 min 5个循环；94 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 45 s ，每个循环退火温度降低1 ℃，共25个循环；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 45 s，72 ℃ 10 min。

1.4.3 易错PCR突变文库的建立

S. cerevisiae BJ5465感受态细胞的制备：挑取S. cerevisiae BJ5465单克隆于5 mL YPD液体培养基中，30 ℃、250 r/min振荡培养过夜；以1%接种量转入50 mL YPD液体培养基，30 ℃、250 r/min培养至OD600约为1.0~1.5。收集菌液至50 mL离心管中，4 000 r/min离心10 min，弃上清。用溶液Ⅰ(0.1 mol/L醋酸锂+0.01 mol/L二硫苏糖醇+1 mol/L TE) 重悬沉淀，冰浴1 h，4 000 r/min离心10 min弃上清，25 mL冰浴无菌水重悬，4 000 r/min离心10 min弃上清，重复操作一次。用5 mL冰浴的溶液Ⅱ (1 mol/L山梨醇) 重悬沉淀，4 000 r/min离心10 min弃上清。加入200 μL冰浴的溶液Ⅱ，悬浮菌体，分装[16]。

重组质粒的构建及转化：将PCR产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳纯化回收，命名为adtzmut。用XhoⅠ、NotⅠ限制性内切酶纯化 PCR产物，纯化后的易错PCR产物与同样双酶切的穿梭分泌表达载体 pYCα混匀，用T4 DNA连接酶4 ℃过夜连接。连接产物热激转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，涂布在含Amp的LB平板，37 ℃培养16 h后将平板上所有克隆转入含有Amp的液体LB培养基中，37 ℃、200 r/min培养过夜。提取大肠杆菌DH5α中重组质粒，采用电转化的方式[17-18]，转入 S. cerevisiae BJ5465感受态细胞后迅速加入预冷1 mol/L山梨醇，涂布在SC-U-D平板上，30 ℃培养48 h。

1.4.4 重组子的鉴定

挑取1.4.3中平板上单克隆，提取质粒，用限制性内切酶XhoⅠ、NotⅠ双酶切和PCR鉴定含有突变基因的重组子pYCα-adtzmut是否构建成功。

1.5 易错PCR突变文库的筛选

1.5.1 突变酶ADTZ的初筛

挑取单克隆接种到YPGal液体培养基的96 孔板中进行诱导培养，30 ℃摇床培养72 h后取上清液。酶活力的检测[14-19]：实验组 (总体系200 μL)——取20 μL培养上清粗酶液加入到含有 AFB1 4 μL、 pH 5.8 0.02 mol/L Na2HPO4-0.01 mol/L柠檬酸缓冲液131 μL、5 μL HRP (2.5×10−4mol/L) 和40 μL的隐性亮绿 (1.0×10−4mol/L) 的酶标板中；对照组——把4 μL AFB1替换成4 μL甲醇，其他成分与实验组相同。加入酶液后立即测量630 nm 波长的吸光值，然后在30 ℃温育30 min 再次检测630 nm波长的吸光值，用△OD630表示相对酶活力的高低。为了排除HRP也能降解AFB1的干扰，分别以含有 pYCα空质粒和携带野生型 adtz基因的S. cerevisiae BJ5465作为阴性对照和阳性对照，对文库进行定性筛选，△OD630高于野生型的克隆将进入下一轮筛选。

高温 (70 ℃) 处理：取上清粗酶液，在70 ℃水浴30 min后，然后取处理过的酶液进行酶活的测定。酶活测定的条件是在30 ℃、pH 6.0、0.04 mol/L磷酸氢二钠-0.02 mol/L柠檬酸缓冲液环境下进行。酸(pH 4.0) 处理：取上清粗酶液和pH 2.5缓冲液混合后，使最终体系的pH为4.0，在25 ℃水浴30 min后，再测定相对酶活力。碱 (pH 7.5) 处理：取上清粗酶液和pH 7.5缓冲液混合后，使最终体系的pH为7.5，在25 ℃水浴30 min后，再测定相对酶活力。酶活力定义：一个单位 (U) 定义为在30 ℃，pH 6.0的反应条件下，每分钟将AFB1转化释放1 pmol H2O2所需要的酶量。

1.5.2 突变酶ADTZ的复筛

将 1.5.1筛选到的优秀克隆再在同样条件处理后，以AFB1为底物，用HPLC测定样品反应组和样品空白组中所残留的AFB1计算突变体的酶活力。酶活力定义：一个单位 (U) 定义为在30 ℃，pH 6.0的反应条件下，l分钟降解l pmol AFB1所需的酶量。

1.6 酶的诱导表达

将经初筛和复筛获得的优良性质的S. cerevisiae BJ5465重组子接种于含2%半乳糖的YPGal培养基扩大培养，诱导表达突变酶，取上清液，按Bradford法测定[20]其蛋白质的含量并进行酶学性质的初步分析。

1.7 酶学性质分析

1.7.1 温度和pH对酶活性的影响

将突变克隆培养酶液分别在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃温度下，通过外标法定量检测得到样品反应组和样品空白组中所残留的 AFB1，两者比较计算出酶活力。在不同的pH (3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0) 的缓冲液(0.04 mol/L Na2HPO4-0.02 mol/L 柠檬酸) 下，通过外标法定量检测得到样品反应组和样品空白组中所残留的AFB1，两者比较计算出酶活力，以突变酶的最高酶活力为100%，计算各组酶的相对活力。

1.7.2 热稳定性和pH稳定性

将突变克隆培养酶液分别在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃温度下保温30 min，然后在pH 6.0的缓冲液下用外标法定量检测得到样品反应组和样品空白组中所残留的AFB1，两者比较计算出酶活力，以突变酶的最高酶活力为100%，计算各组酶的相对活力。将突变克隆培养酶液分别在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液中于25 ℃保温30 min，然后在pH 6.0的0.04 mol/L Na2HPO4-0.02 mol/L 柠檬酸缓冲液下用外标法定量检测得到样品反应组和样品空白组中所残留的AFB1，两者比较计算出酶活力，以突变酶的最高酶活力为100%，计算各组酶的相对活力。

1.8 突变酶突变位点分析

将筛选获得的优良性状突变体，进行测序 (由北京奥科生物公司完成)，并对其关键氨基酸进行分析。

2 结果

2.1 易错PCR突变库的建立

2.1.1 易错PCR条件的确立

在易错 PCR反应体系中分别加入不同体积的MnCl2，形成0、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20 mmol/L的浓度梯度；同时MgCl2浓度增加到7 mmol/L以稳定非互补的碱基对，dCTP和dTTP的浓度增加到1 mmol/L以促进碱基错配的倾向性，其中 Mg2+和Mn2+的浓度被调整，可以得到不同突变频率的文库。从突变库中随机挑取10个克隆进行测序，碱基的突变频率为4.64%，符合EP-PCR文库突变原则。

2.1.2 易错PCR突变库的建立

将易错 PCR产物克隆到大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体 pYCα上，重组质粒在大肠杆菌 DH5α中扩增后转入酿酒酵母S. cerevisiae，结果所构建的突变克隆库库容约为1.0×104。

2.2 易错PCR突变文库的筛选

所建立的EP-PCR文库按图1的流程进行初筛和复筛。

2.2.1 初筛

用HRP测活方法对黄曲霉毒素解毒酶EP-PCR突变文库 (约104) 克隆进行初步筛选。ADTZ催化AFB1产生的H2O2能使无色的RGB转化成BG，其直观的颜色变化见图 2，筛选得到的阳性克隆见图中标记的。

筛选得到酶活力高于野生型约的突变体 5 000个。将这5 000个克隆分别在70 ℃、pH 4.0、pH 7.5的环境中处理30 min后测定其酶活，结果见图3。

2.2.2 复筛

对通过选择压力初筛得到的约 500个突变体克隆进行复筛，用HPLC检测底物减少量的图谱见图4。突变酶A1476经pH 4.0、30 min处理后测活，酶活力是野生型的21倍，突变酶A1773经pH 7.5、30 min处理后测活，酶活力比野生型提高了6.5倍，突变酶A2863经70 ℃ 30 min 处理后测活，酶活力比野生型提高了12.6倍 (表1)。

表1 突变酶在各自的选择压力下对底物AFB1的酶活力测定结果Table 1 The results of mutants specific activity with AFB1 in the pressure of their choice

2.3 突变酶的酶学性质分析

2.3.1 突变酶的最适温度和最适pH值

突变酶A1476和A1773在50 ℃和pH 4.0条件下表现最佳酶活，最适反应温度比野生型提高了10 ℃，最适pH由野生型的pH 6.0降低到了pH 4.0，而 A1476比 A1773有较宽的反应温度范围，A1476残留活性在60%以上的酶促反应温度范围为30 ℃~65 ℃，而A1773残留活性在60%以上的酶促反应温度范围为35 ℃~55 ℃；突变酶A2863的最适 pH范围扩大到 pH 4.0~7.0，而野生型的最适pH只在pH 5.5~6.5狭窄的范围 (图5~6)。

图1 易错PCR文库的筛选流程图Fig. 1 Scheme of screening EP-PCR libraries.

图2 HRP-RBG系统对ADTZ突变体的初筛结果Fig. 2 Results of HRP-RBG screening. The areas of A1-H1, A2-H2 and A3-H3 are standard curve, the areas of ellipse are positive clones.

图3 EP-PCR突变库筛选结果Fig. 3 Results of EP-PCR screening mutants. X: thermal (70 °C) stability; Y:weak alkaline (pH 7.5) stability; Z: acid (pH 4.0) stability. ★ : XYZ; ▲: XY;□: ZX; ○: YZ.

图4 HPLC检测AFB1的图谱Fig. 4 Map of AFB1 detected by HPLC. The black line is the control group; The red line is the experimental group.

图5 温度对突变酶的酶活力影响Fig. 5 Effect of temperature on the activity of evolved enzymes.

图6 pH对突变酶的酶活力影响Fig. 6 Effect of pH on the activity of evolved enzymes.

2.3.2 突变酶的热稳定性和pH稳定性

突变酶A1773在50 ℃~70 ℃有较好的稳定性，突变酶A1773在70 ℃温浴30 min，残留酶活力仍达到90%，而野生型酶在40 ℃以上酶活力丧失超过了50%。野生型的酶在pH 6.0和30 ℃表现出最好的稳定性，而在其他环境下，酶活力下降得很快。A1476和A2863在酸性环境有较好稳定性，经pH 4.0处理30 min，残留酶活力仍达80%以上；A2863经pH 7.5处理30 min，残留活力仍达80%，pH稳定性扩大到pH 7.5 (图7~8)。

图7 突变酶的温度稳定性Fig. 7 Thermal stability of evolved enzymes.

图8 突变酶的pH稳定性Fig. 8 pH stability of evolved enzymes.

2.4 突变酶的突变位点分析

经过测序结果，分析突变位点发现：2个克隆均存在Ile307Leu的突变，我们推测307位点与酸性稳定性有关；推测第 127位的 Lys和第 613位的Arg与热稳定有关，推测第73位可能与碱性稳定性有关。

表2 突变酶碱基和氨基酸变化Table 2 Nucleotide substitution and amino acid change of mutants

3 讨论

由于对黄曲霉毒素解毒酶的三维结构以及催化机制等信息了解得还不够充分，对其进行理性设计存在很大难度，因此不可能利用传统的蛋白质工程方法对黄曲霉毒素解毒酶进行改造。定向进化能够快速鉴定适应性突变，以最小的序列变化产生大的表型差异，从而使氨基酸序列差异与蛋白质功能差异之间的真正相互关系变得明朗，相当大地简化了序列比较分析工作。在随机突变实验中，要考虑的重要因素是突变频率。本研究设置不同浓度的Mn2+进行易错PCR，同时控制Mg2+的浓度，得到不同突变频率的多样性文库，一般为每个基因1~5个碱基，对应的氨基酸突变数是 1~2个，控制合适的突变率为0.5%~2%之间。由于突变体的表达系统是分泌型酿酒酵母，虽然解决了外源蛋白直接分泌到培养基中利于快速筛选，但因酿酒酵母转化率低，需要经过多次的基因操作来扩大库容。本实验从感受态的制备和转化条件两方面优化，摸索了 7种条件，最终确定醋酸锂法制备感受态和电转化结合的方案。AFB1的检测不仅是一个耗时、高成本、而且是毒性危险性高的操作，为了解决定向进化过程海量检测的问题，根据前期研究的结果表明[14]：黄曲霉毒素解毒酶催化AFB1时会产生H2O2，本实验设计了以隐性亮绿 (RBG) 为检测系统易化筛选方法，即：以隐性亮绿 (RBG) 为底物，在pH 5.0~6.0条件下经辣根过氧化物酶 (HRP) 催化RBG使其氧化为染料亮绿 (BG)，染料亮绿 (BG) 及酶催化反应产物的最大吸收峰均位于630.6 nm处，可通过简单的测定630 nm处的吸光值变化来估算黄曲霉毒素解毒酶的活力。利用该系统大大地加快了筛选效率，并收到了良好的效果。

本研究采取易错PCR对黄曲霉毒素解毒酶adtz基因进行定向进化，建立了简单、快速的高通量筛选方法，并且成功地获得了pH 4.0稳定和pH 7.5稳定性的突变酶A1476、A2863，其中A2863在pH 4.0稳定和 pH 7.5均表现出较好的稳定性，突变酶A1773在70 ℃有较好的稳定性。从突变酶的序列分析可看出：A1476和A2863均具有pH 4.0的稳定性的性质，两个克隆均存在Ile307Leu的突变，我们推测307位点与酸性稳定性有关。突变酶A1773存在Glu127Lys、Gln613Arg突变，因此，我们推测第 127位的Lys和第613位的Arg与热稳定有关，A2863出现 Gly73Ser、Ile307Leu、Val596Ala和Gln613Arg的突变，它存在Gln613Arg位点的突变，而没有出现热稳定的性质，可能由于突变的位点比较多，其他位点的突变导致丧失该性质。与其他突变体比较A2863出现Gly73Ser位点的突变，而具有pH 7.5的稳定性，因此，推测第73位可能与碱性稳定性有关。本实验为了便于筛选，选择了酿酒酵母为宿主菌和采用附加型表达质粒，目标蛋白的表达量偏低，用培养基上清测定突变体酶活的比活仍较低，在以后的研究中可通过将这些突变酶的基因转入毕赤酵母等高表达系统来提高目标蛋白的表达量。致谢：暨南大学再生医学教育部重点实验室蔡冬青老师实验室在本工作的完成过程中提供 Bio-Tek多功能酶标仪给课题组使用，使高通量筛选工作效率得到极大提高，在此表示衷心地感谢。

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