吴 敏，王星果，张 营，徐建荣，顾志良

（常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

鳡(Elopichthys bambusa)属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、雅罗鱼亚科(Leuciscinae)、鳡属.主要分布于我国长江中下游的江河湖泊中，为大型经济鱼类之一[1].鳡性猛贪婪，是凶猛的肉食性鱼类，在保持水体生态平衡中起着重要作用；又因其肉质鲜美，被列入大型上等食用鱼类[2].近年来因环境恶化和过度捕捞等因素，鳡资源遭到了严重的破坏，种群数量急剧下降，已被列入国家重点保护濒危及受威胁水生物种名录[3]．

鱼类线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）同其他脊椎动物的线粒体DNA一样，是细胞质中具自主复制、转录和翻译能力的共价闭合环状双链DNA，包括一条重链和一条轻链[4].鱼类线粒体DNA具有分子小、结构简单、重组率低、进化速度快、不同区域进化速度存在差异等特点，是鱼类进化遗传学、分子生态学、遗传多样性及其保护生物学等研究的重要标记[5].在NADH氧化还原酶基因中，ND5基因进化速度相当快，是作为相关种群系统发育研究最有用的基因之一[6].ND5基因在昆虫的分子系统学中研究较多，叶维萍等[7]对中国飞蝗3亚种的线粒体12S rDNA（487 bp）和ND5（451 bp）基因的部分序列进行测定，与已知线粒体基因组全序列的非洲飞蝗亚种进行序列比较，并对ND5基因以斑腿蝗科瘤喉蝗为外群重建最简约树，以研究它们的生物地理关系．

目前，国内外对鳡的繁殖、养殖等研究较多，而对其在基因水平上的研究很少.基因库中目前尚未有鳡线粒体ND5基因序列的报道.本研究利用相应的引物对鳡线粒体ND5基因进行PCR扩增并克隆测序，获得了ND5基因全序列，并对ND5基因进行碱基组成及密码子使用情况分析，还对ND5基因进行系统进化分析.研究结果将为鱼类其它物种的系统分类提供参照，又可为鳡的系统分类提供分子水平的证据，同时也可为今后鳡的资源保护、开发和养殖提供相应的理论依据．

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用动物长江鳡鱼来源于苏州市长江特色水产繁殖工程中心，活鱼宰杀后，采集其肌肉组织存放于-20℃冰箱保存备用.用常规苯酚-氯仿法提取鳡基因组DNA．

1.2 引物设计与合成

根据GenBank数据库中已公布的鲤鱼和斑马鱼等其他鱼类线粒体基因组ND5基因侧翼序列信息设计引物Gynd4F2：5-TATCCTAGCACTATGAGGTG-3，Gynd6R4：5-TGGCTGAGGATAGGGTTAAG-3.引物由上海生工生物工程有限公司合成．

1.3 ND5基因的PCR扩增

PCR扩增在25μL反应体系中进行：0.2μL ExTaq 酶（5U·μL-1，TaKaRa Tokyo，Japan），2.5μL 10×PCR ExTaq Buffer（with Mg2+），2μL dNTP（2.5 mmol·L-1each），上、下游引物各1μL（10μM），DNA模板（100ng/μL）1 μL，加灭菌水至25μL.PCR扩增条件为95℃变性3min；95℃ 30 Sec，60℃30Sec，72℃2min 30Sec，30次循环；72℃延伸10min；4℃保存．

1.4 ND5基因的克隆与测序

将PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的片段.将回收片段克隆到pMD18-T Vector（TaKaRa大连生物公司）中，挑取阳性菌落，于LB液体培养基Amp+中摇菌培养，提取质粒，经鉴定后将重组质粒送往上海桑尼生物科技公司进行测序．

1.5 数据分析

用DNAMAN软件，将测得鳡ND5基因序列与参照物种ND5基因序列比对，得到它们同源性的远近.利用Clustalx软件，对鳡和参照物种ND5基因序列进行比对，利用MEGA 4.0软件，用NJ法构建分子系统进化树.

2 结果与分析

2.1 鳡ND5基因的PCR扩增

采用引物Gynd4F2/Gynd6R4，扩增鳡ND5基因.扩增得到一条特异性的条带，片段长度在2200bp左右，与预期结果相符（图1）．

图1 PCR扩增鳡线粒体ND5基因片段M：DL-2000分子量标记1.扩增片段M：DL-2000 Marker 1、PCR amplification fragment

2.2 鳡ND5基因的序列组成

将上述扩增片段克隆后进行测序，得到鳡ND5基因序列全长为1836bp（GenBank登录号：HQ844003），见图2.四碱基含量分别为T29.6%，C26.0%，A32.9%，G11.4%，A+T含量为62.5%；密码子第三位上碱基含量为T26.8%，C27.9%，A42.6%，G2.6%，A+T含量为69.4%，见表1.比较ND5基因总的碱基组成和密码子第三位点的碱基组成，发现两者都富含A、T，G、C含量较低，且存在反G偏倚.比较ND5基因密码子三个位点的碱基组成，发现第一位点各碱基使用较为平均，没有明显的偏倚；第二位点富含T，含量为41.5%，存在一定的反G偏倚；第三位点A含量最高，为42.6%，有明显的反G偏倚，含量仅为2.6%．

将鳡ND5基因核酸序列翻译成氨基酸序列时，密码子的使用情况如表2所示.在所有的密码子中，UGG、CGU、CUG、CCG、CGG、AGA、AGG、GCG没有使用到.使用频率最高的是AUU（40.0%），其次是CUA（38.0%）；除终止密码子外，使用频率最低的是UUG、UCG、CGC、ACG、AAG、GUG、GAG、GGG（均为1.0%）．

表1 鳡ND5基因及其密码子各位置的碱基组成及含量(%)

鳡ND5基因编码611个氨基酸残基的多肽，氨基酸序列见图2.其中含量最高为Leu(15.55%)，含量最低的是Cys（0.82%），见表3．

2.3 鳡ND5基因与其他物种的同源性比较

利用DNAMAN软件，将鳡ND5基因DNA序列和氨基酸序列与草鱼、鲫鱼、剑尾鱼、鲤鱼、鲢鱼、翘嘴鲌、青鱼、团头鲂、鲟鱼、鼠10个物种分别进行比对，得到鳡与其他物种的同源性系数，结果见表4.从表中可知，鳡鱼与鲢鱼的碱基同源性最高（85.93%），其次是青鱼，同源性为85.88%，鳡与鼠的碱基同源性最低，只有64.10%．除剑尾鱼与鼠之外，鳡与其他几个物种的氨基酸同源性都较高．

2.4 不同物种间的遗传距离

利用MEGA4.0软件计算出各个物种间的遗传距离，结果见表5.由表可知，鳡与鲢鱼之间的遗传距离最小，为0.135，其次是青鱼，为0.139.与鼠的遗传距离最大，为0.488.物种间两两比较的遗传距离中，鲢鱼和青鱼的遗传距离最小，为0.102．

2.5 基于ND5基因序列的系统进化树

利用Clustalx软件，将鳡ND5基因与其他10个物种进行比对，再用MEGA 4.0软件中的NJ法构建分子进化树.结果如图3所示，以鼠为外群，其余10个物种为内群，从所构建的系统树可以看出，内群的10个物种分为2个支系，第1支系只有剑尾鱼；第2支系由翘嘴鲌、团头鲂、青鱼、草鱼、鲢鱼、鳡鱼、鲫鱼、鲤鱼、鲟鱼组成，其中前8种鱼类都属鲤形目鲤科，鲟鱼属鲟形目鲟科.在第2支系中，翘嘴鲌与团头鲂先聚为姊妹群，BCL值为93%，然后与青鱼聚合，BCL值为50%，再与草鱼聚合，BCL值为84%，而后与鲢鱼聚合，BCL值为92%，最后与鳡聚合，BCL值为 100%；鲫鱼与鲤鱼聚为姊妹群，BCL值为100%；鲟鱼独立分支出来．

图2 鳡ND5基因核苷酸和氨基酸序列

表2 鳡ND5基因的密码子使用情况

续表

表3 鳡ND5基因编码的氨基酸含量

3 讨论

本文分析了ND5基因的序列特征.比较基因的碱基组成发现，A+T的含量都大于G+C，表现出AT的相对丰富以及GC的相对缺乏，符合动物线粒体基因组的碱基组成特点[8].比较基因密码子三个位置碱基组成发现，第二位上碱基都存在T偏倚和反G偏倚，第三位存在明显的反G偏倚，说明这两个位点对核苷酸有偏好使用.在脊椎动物中，第三位的反G偏倚主要是因为该位点的碱基在进化上选择压力比其他两个位点小[9]．

表4 鳡与其他物种ND5基因同源性比较

表5 不同物种ND5基因间的遗传距离

从表5的遗传距离可以看出，鳡与鲢鱼的遗传距离最小（0.135），其次是青鱼（0.139），这与形态学上的分类[10]不尽一致.形态学上这三者同属鲤形目鲤科，鳡鱼和青鱼同属雅罗鱼亚科，而鲢鱼属于鲢亚科、鲢属．

系统发生树分支大体：啮齿目小鼠作为外群，内群分为两支，银汉鱼目剑尾鱼为独立的一支；另一支包括鲤形目鲤科的翘嘴鲌、团头鲂、青鱼、草鱼、鲢鱼、鳡鱼、鲫鱼、鲤鱼，鲟形目鲟科的鲟鱼独立分支出来，表明鲤形目和鲟形目亲缘关系较近，而银汉鱼目与它们的亲缘关系相对较远，与形态学分类一致；鲤科的几种鱼类又可分为两支，翘嘴鲌、团头鲂（鲌亚科）、青鱼、草鱼、鳡鱼（雅罗鱼亚科）、鲢鱼（鲢亚科）为一支，鲫鱼和鲤鱼（鲤亚科）聚为姊妹群，为另一支，表明雅罗鱼亚科、鲌亚科和鲢亚科之间的亲缘关系很近，而鲤亚科与它们的亲缘关系相对较远．

系统发生树结果与形态学分类也不完全一致，可能因为ND5基因的进化速度比较快，用于科属间的亲缘关系比较可能存在一定的误差，在进一步的研究中将结合其他线粒体基因作为遗传标记，以获得更加客观的系统分类．

图3 由邻接法构建的系统发生树（基于ND5基因序列）

[1]刘建康，何碧梧.中国淡水鱼类养殖学[M].第三版.北京：科学出版社，1992：750.

[2]朱宁生，陈宏溪.梁子湖中鳡鱼的食性[J].水生生物学集刊，1959，（3）：262-271.

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