左 玲，宁乐平

(1.湖北省荆门市第一人民医院，湖北荆门448000;2.武汉大学中南医院，武汉430071)

钟祥市是中国六大长寿地区之一，据第五次人口普查资料显示，钟祥市人均寿命为75.88岁，高于中国平均水平4.48岁，比世界平均水平高9.88岁。世界卫生组织［1］认为，人的寿命与四大因素有关，一是遗传，占15%;二是社会环境与自然环境，占17%;三是医疗卫生水平，占8%;四是生活方式与生活习惯，占60%。早前的研究表明［2］，人体内血浆总胆固醇(cholesterol，TC)、三酰甘油(triacylglycerol，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low densitylipoprotein cholestorol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholestorol，HDL-C)和游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)，特别是FFA的亚组分，与长寿有密切的联系。多不饱和脂肪酸的不饱和双键结构的脂肪酸，根据第一个不饱和键位置不同可分n-6、n-3两大类［3］。本实验中收集湖北钟祥长寿村老人的血浆，检测TC、TG、LDL-C、HDL-C等血脂指标，并用高效液相色谱(HPLC)法分析其血浆FFA亚组分，探讨长寿村老人血浆FFA亚组分。

1 对象与方法

1.1 研究对象 长寿村组样本均来自荆门地区钟祥乡镇居住的长寿村老人。样本选择标准:女≥85岁，男≥75岁。包括男84例，平均年龄(83.47±16.87)岁，女 38 例，平均年龄(88.31 ±16.70)岁。正常对照组样本均来自荆门地区非长寿村居住的市区居民老人。样本选取标准:女≤85岁，男≤75岁，共94例，其中男54例，女40例，平均年龄(80.08±10.02)岁，皆无糖尿病家族史，无肥胖、高血压、冠心病、肝、肾和甲状腺疾病。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器 Dionex Summit高效液相色谱仪，Dionex P680A低压四元梯度泵，Dionex PDA-100紫外/可见二极管阵列检测器，Dionex ASI-100自动进样器，Dionex TCC-100柱温箱，Dionex变色龙数据处理软件系统。

1.2.2 试剂 月桂酸(C12∶0)、豆蔻酸(C14∶0)、软脂酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、软油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)等标准品，以及溴苯乙酮、三乙胺均购自SIGMA公司。异丙醇、乙腈等购自上海国药集团。

1.3 方法

1.3.1 标本收集 体格检查后采集空腹静脉血5 mL，抗凝、离心、分离血浆，一部分用来检测 TC、TG、LDL-C、HDL-C等血脂指标，一部分 －80℃冰箱保存，以分析FFA。

1.3.2 血脂分析 用全自动生化测定仪测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、载脂蛋白 A 和血糖(blood sugar，GLU)水平。

1.3.3 FFA 萃取 根据文献方法［4］，血浆解冻，取玻璃管一支，先后加入0.2 mL血浆、1 mL萃取液，加入 20 μL 100 mg/L C17∶0 作为内标，振荡混匀，室温下孵育10 min。加入0.4 mL正庚烷和0.6 mL水，充分振荡混匀、离心，取400 μL上层有机相，小心转移至玻璃试管内。氮气吹干、酯化。

1.3.4 FFA衍化 根据文献方法［5］，氮气吹干的血浆样品或脂肪酸标准品中加入50 μL 20 g/L 2-溴苯乙酮和50 μL 25 g/L三乙胺的丙酮溶液，混匀。于90℃水浴、冷却。再加入75 μL 10 g/L的醋酸丙酮溶液，混匀、离心。90℃水浴、冷却。氮气吹干后密封，用流动相重新溶解，混匀、离心去除颗粒，进样分析。先配置混合标准品(表1)。再用单个FFA标准品定性，确定每一个峰代表的FFA亚组分。上机条件为:柱温37℃;检测波长242 nm;流动相为甲醇∶乙腈∶水 =82∶9∶9，流速为1.0 mL/min。制作标准曲线。

表1 混合标准品中10种FFA的浓度

1.3.5 方法学评价

1.3.5.1 各种FFA亚组分标准曲线线性范围、回归方程、相关系数、检测限 本实验FFA标准曲线在分析范围内线性关系良好(R2＞0.99)。日内(n=6)相对标准差(RSD)为0.9%～3.5%，日间(n=6)RSD为1.5%～ 4.4%，检测限为 0.05 μmol/L(C20∶5)～0.35 μmol/L(C16∶0)，灵敏度足以检测痕量的 FFA。

标准曲线的制作:根据预试验中FFA所测的浓度，确定标准曲线浓度的覆盖范围。将9种单个游离脂肪酸标准品混合成混合标准品溶液，进行连续6次倍比稀释，每种浓度下取混合标准品溶液200 μL，加入 20 μL 100 mg/L C17∶0，氮气吹干，后续步骤同实际样本，每种浓度平行做3组。以各FFA峰面积与内标峰面积之比为横坐标(X)，各FFA浓度为纵坐标(Y)，进行回归分析。

1.3.5.2 精密度及回收率测定 取人血浆标本一份，加入高、中、低3种浓度(表1)的混合FFA标准品溶液，3种浓度平行做8组，按前述步骤进行色谱分析，计算样品回收率和相对标准偏差。将6个相同浓度的样品，随机插入同一天不同处理批次中，在1 d内不同时间进样，计算日内RSD;同一批次处理6个相同浓度样品，置－20℃冰箱保存，连续6 d于相同时间进样，计算日间RSD。各种FFA亚组分高、中、低3种浓度回收率及精密度:高、中、低3种浓度(n=8)的回收率为 96.4%～104.8%，精密度为1.5%～4.9%，符合《生物材料分析方法的研制准则》相关要求。

1.4 统计学方法 所有数据均使用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料数据采用均数±标准差(±s)表示，多组间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 长寿组与正常对照组典型色谱图 两组标本中FFA所测亚组分的典型色谱图(图1)所示，色谱图横坐标为保留时间(min)，纵坐标为毫吸光度单位(mAU)，其中包含10个吸收峰图，每个峰代表一种FFA，在同一色谱条件下，每种FFA的保留时间(即出峰时间)是固定的。

图1 长寿组与正常对照组典型色谱图

2.2 两组各检测指标比较 长寿组与正常对照组比较，GLU、TC、TG、HDL-C、TFA、不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)明显升高(P ＜0.05)，LDL-C显著降低(P＜0.01)，但均未超出正常值范围。从亚组分来看，C12∶0、C16∶0、C18∶0、C16∶1、C18∶1、C20∶5 都显著升高(P ＜0.05)，而 C18∶2 却显著降低(P ＜0.01)(表2)。

3 讨论

湖北钟祥长寿村是我国六大长寿村之一，一直受到很多学者的关注。从宏观看，人的寿命与遗传、社会环境与自然环境、医疗卫生水平、生活方式与生活习惯等几大因素相关。本实验从TC、TG、LDL-C、HDL-C以及FFA的亚组分角度，探讨其与钟祥长寿的相关性。

实验结果显示，长寿组与非长寿村健康人群比较，GLU、TC、TG、TFA、UFA 等指标都明显升高，但均未超出正常值范围。国内相关筛查表明［6］，人体内的血脂指标随着年龄而增长。FFA作为血脂成分之一，长寿组中FFA总浓度［7］，也明显升高。从亚组分来看，C12∶0、C16∶0、C18∶0、C16∶1、C18∶1、C20∶5 都显著升高，而C18∶2却显著降低。

表2 长寿村组与正常对照组血浆脂质、糖及FFA亚组分对比分析(±s)

表2 长寿村组与正常对照组血浆脂质、糖及FFA亚组分对比分析(±s)

注:血糖(GLU);总胆固醇(TC);三酰甘油(TG);高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C);低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C);不饱和脂肪酸浓度(UFA);总游离脂肪酸浓度(TFA)

组别 例数 GLU(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)C12∶0(μmol/L)C14∶0(μmol/L)C16∶0(μmol/L)长寿组 122 5.75±1.71 4.67 ±0.87 1.26±0.76 1.43 ±0.30 2.03 ±0.52 5.00±0.60 14.37 ±8.47 125.48 ±77.25正常对照组 94 5.38±0.34 4.02 ±0.45 0.97±0.32 1.29 ±0.23 2.40 ±0.36 1.57±0.20 14.72 ±9.95 103.69 ±33.00 t 2.067 6.593 3.47 3.75 －5.89 77.25 －0.28 2.56 P＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.05组别 例数 C18∶0(μmol/L)C16∶1(μmol/L)C18∶1(μmol/L)C18∶2(μmol/L)C20∶4(μmol/L)C20∶5(μmol/L)UFA(μmol/L)TFA(μmol/L)长寿组 122 35.21 ±2.44 20.95 ±1.40 161.38 ±9.77 57.84 ±2.95 2.39 ±0.19 1.246 ±0.09 246.40 ±153.66424.42 ±248.06正常对照组 94 25.56±8.32 10.16 ±5.51 106.84±35.66 90.18 ±28.03 2.39 ±0.11 0.79±0.09 209.99 ±65.07 355.55 ±102.40 t 12.16 20.79 16.14 －12.66 0 36.92 2.15 2.53 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05

有研究表明［8］，游离脂肪酸能增强解耦联蛋白的活性，从而减少活性氧的生成，延缓衰老。本研究结果显示，长寿老人血浆中 C12∶0、C18∶0、C16∶1 等三种FFA较正常健康人群显著升高。这些升高的饱和脂肪酸可能减少活性氧的生成，延缓了细胞的衰老。国外营养界的新观点［9］认为:油酸可降低血液总胆固醇和有害胆固醇，却不降低有益胆固醇。本实验结果显示，长寿组中油酸的升高，降低了心血管等疾病的发病率，也是长寿的原因之一。

本实验结果还显示，长寿老人血浆C18∶2显著降低，C20∶5显著升高。人体内多不饱和脂肪酸主要分为n-3族和n-6族脂肪酸，n-3多不饱和脂肪酸摄取量可以促进婴幼儿视网膜、大脑和神经系统发育［10］;而 n-6 族脂肪酸［11］能导致血小板凝集和血栓形成，促进炎性反应，并能促进肿瘤的生长与转移。C18∶2水平的降低对人体有保护作用，C20∶5属于n-3族，其水平升高对人体有保护作用，可能是长寿的关键因素之一。荆门地区钟祥近年来农业植物豆类生产迅速发展，当地居民常吃豆制品，而黄豆中［12］主要含有 C16∶0(13.45%)、C18∶0(3.34%)、C18∶1(18.61%)、C18∶2(54.10%)、C18∶3(9.69%)，其中C18∶2含量占了50%以上。综上所述，中国六大长寿区之一的湖北钟祥，自然环境、生活习惯、饮食习惯等方面都适合人的生存，长寿组人群GLU、TC、TG、TFA、UFA等指标明显升高，FFA亚组分中，饱和脂肪酸、C18∶1和 C20∶5升高，而 C18∶2降低，这些因素是长寿的原因之一。

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