李栋才，邱书奇，赵海亮，杨 贵，姚春燕

(深圳市龙岗中心医院耳鼻咽喉科医院，深圳市耳鼻咽喉研究所，广东深圳518172)

鼻咽癌是我国华南地区、东南亚其他国家和地中海盆地的高发性恶性肿瘤，传统的放疗易出现局部复发及远处转移，因此寻找更有效的鼻咽癌治疗药物具有深远意义。随着分子生物学各项技术的日趋成熟，细胞因子的治疗作为肿瘤治疗的一个新靶点，已成为肿瘤防治研究的一个活跃领域。白细胞介素24(interleukin 24，IL-24)作为一种新发现的细胞因子，可选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无影响，对鼻咽癌的治疗有一定的应用前景。本研究通过细胞计数、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)抑制试验探讨其对鼻咽癌CNE-2Z细胞株增殖的作用，为今后鼻咽癌研究和治疗提供实验依据和研究思路。

1 资料与方法

1.1 鼻咽癌 CNE-2Z细胞株体外培养、细胞计数 鼻咽癌低分化细胞株CNE-2Z由广东医学院分子生物室保存，用含10%灭活小牛血清的RPMI-1640培养液 37℃培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。用含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2×106/mL，在24孔培养板中加入细胞悬液 1.0 mL/孔，每孔细胞数 2 ×106，37℃、5%CO2、100%湿度培养72 h，台盼蓝染色活细胞率＞95%。分别按IL-24 0、5、10、20、50、100 pg/L接种细胞，每个浓度重复3孔，分别于培养 0、12、24、36、48、60、72 h 后收集细胞，0.05%台盼蓝染色，计数不着色细胞，计算存活细胞百分率。每4天半量换液。待细胞进入对数生长期后收集细胞作MTT试验。

1.2 MTT比值法检测细胞增殖抑制率 收集培养48 h的细胞至96孔板，每孔细胞数为2×105，血清浓度调整为10%，每孔体积为200 μL，每孔加 MTT 20 μL，37℃继续培养 4 h;然后离心吸弃上清，每孔加二甲基亚砜200 μL，微量振荡器上振荡10 min，待紫色结晶完全溶解后，用酶标仪检测各组细胞A570/A630吸光值，以0 pg/L IL-24组为对照组，计算IL-24对鼻咽癌细胞株CNE-2Z的抑制率。抑制率=(1－用药组A值/对照组A值)×100%，作出量效关系曲线，寻找抑制率最高的IL-24浓度，就是IL-24作用的峰浓度。以峰浓度的IL-24为实验组，不加IL-24为对照组，在培养的 12、24、36、48、60、72 h 后，用 MTT比色法检测CNE-2Z的生长抑制率，作时效关系曲线，以了解细胞增殖状况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析。本实验数据资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较使用方差分析F检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外培养细胞计数的变化 鼻咽癌CNE-2Z细胞株在培养的第48 h生长状况最差，并且随着IL-24浓度的增加，其活细胞数也随着减少。当IL-24为50 pg/L时，其增殖状况最差;当 IL-24为100 pg/L时，其增殖状况反而好转(表1，图1)。

表1 鼻咽癌细胞株CNE-2Z的增殖状况(×104/mL)

图1 体外培养的NPC细胞株CNE-2Z的增殖状况

2.2 MTT比色法检测 IL-24对鼻咽癌CNE-2Z细胞株的抑制率。

2.2.1 不同浓度IL-24培养48 h对鼻咽癌CNE-2Z细胞株增殖的影响 IL-24 浓度为 5、10、20、50、100 pg/L时，对鼻咽癌CNE-2Z细胞株的抑制率分别为(8.6 ±2.2)%、(14.6 ±3.1)%、(35.6 ±5.6)%、(58.0 ±6.8)%、(42.0 ±5.2)%，各时间点的抑制率比较差异有统计学意义(F=221.7，P ＜0.05)。IL-24浓度在0～50 pg/L范围内，随IL-24浓度增加，其对鼻咽癌 CNE-2Z细胞株的抑制作用递增，当IL-24＞50 pg/L其对鼻咽癌CNE-2Z细胞株的抑制作用有所减弱(图2)。

图2 不同浓度IL-24在培养的48 h对鼻咽癌CNE-2Z细胞株增殖的影响

2.2.2 IL-24浓度50 pg/L作用不同时间点对鼻咽癌CNE-2Z细胞株增殖的影响 IL-24浓度为50 pg/L作用 12、24、36、48、60、72 h，对鼻咽癌 CNE-2Z细胞株的抑制率分别为(15.0 ±1.1)%、(17.0 ±1.6)%、(35.0 ± 2.5)%、(58.0 ± 4.6)%、(48.6 ±4.2)%、(46.0 ±4.6)%，各时间点的抑制率比较差异有统计学意义(F=492.9，P ＜0.05)。在 48 h内，随着作用时间的延长，其抑制作用递增，当作用时间＞48 h，其抑制作用有所减弱(图3)。

图3 IL-24 50 pg/L作用不同时间对鼻咽癌细胞株CNE-2Z增殖的影响

3 讨论

鼻咽癌严重威胁人类的身体健康。世界大部分地区发病率较低，一般在1/10万以下，其发病有着明显的区域性和种族差异，好发于黄种人而白种人少见。尽管IL-24对乳腺癌、肝癌、直肠癌等细胞凋亡作用的研究已取得了较多的成果，但鼻咽癌作为中国南方多发的癌症，目前有关IL-24对鼻咽癌细胞凋亡作用的研究比较少。

IL-24(mda-7黑素瘤分化相关因子)是近年来发现的很有应用前景的细胞因子，IL-24是一种潜在的肿瘤抑制剂［1］。应用外源性的IL-24可抑制多种肿瘤细胞的生长，并诱导其凋亡，但它对正常的细胞无损害［2-4］。IL-24基因可以在过表达水平下通过各种信号通路和途径诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞没有影响，且凋亡诱导作用不依赖p53、p21等抑癌基因的活性。更因为它同时具有抗血管生成以及抑制肿瘤细胞的浸润和转移的作用，使得它在体内和临床实验中也可以取得良好的实际效果［5，6］，此外，也有体内试验证实，将Ad-mda7处理后的纤维肉瘤细胞注射入小鼠，有免疫系统的小鼠中肿瘤细胞无法生长，而在无免疫系统的小鼠中肿瘤细胞却可以生长［7］。目前一些抗肿瘤药物［8］和免疫调节药物［9］已在被尝试与mda27基因联合使用，以探索加强肿瘤杀伤效果以及克服耐药性。而更新、更有效的病毒载体的探索也在进行中，比如用腺相关病毒1成功介导mda-7基因抑制肿瘤生长［10］，以及内质网靶向的腺病毒载体搭载mda27基因(Ad2ER2mda7)加强了对肿瘤细胞的杀伤作用［11］，这些都对如何更加有效地发挥mda27的抗肿瘤作用提供了研究思路和方向。

近来的研究表明，不需要通过腺病毒介导，纯化的IL-24也可抑制多种肿瘤细胞增殖，并诱导其凋亡［12，13］。国内苑兴卉等［14］以重组腺病毒作为载体通过凋亡实验证实了mda-7基因针对鼻咽癌细胞株CNE-2Z的凋亡诱导效果;但纯化的IL-24对鼻咽癌细胞株CNE-2Z增殖的影响尚未见报道。应用一定剂量外源性IL-24诱导其鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡而不损伤正常细胞是否能成为有效治疗该病的切入点，尚待进一步研究。

本实验应用外源性的IL-24作用于鼻咽癌细胞株CNE-2Z，结果发现IL-24可呈时间和剂量依赖性地抑制鼻咽癌细胞株CNE-2Z增殖。应用细胞计数得出:IL-24可抑制体外培养的鼻咽癌细胞株CNE-2Z的增殖，在IL-24浓度为0～50 pg/L时呈剂量依赖性。而当IL-24浓度为100 pg/L时，其增殖状况反而好转，存在峰浓度效应;并且在第48小时其增殖情况最差。同时本实验应用MTT比色法测定不同浓度IL-24作用后的细胞增殖受抑制的情况，得出IL-24对鼻咽癌细胞株CNE-2Z的抑制率呈明显的峰浓度效应。IL-24浓度为50 pg/L时，对细胞的抑制率最高，低于或高于该浓度其抑制率均有所减低。并且在48 h其抑制率最高。细胞因子在刺激或抑制细胞增殖过程中，均存在峰值浓度，低于或高于峰值浓度，效果反而下降，峰浓度为最大效应浓度。IL-24作用的信号转导都是通过与受体结合来实现，与受体结合可以使信号转导蛋白和转录激活物3和信号转导蛋白和转录激活物1发生磷酸化作用，同时向细胞核移动［13］。所以IL-24的峰浓度效应可能与受体饱和等因素有关，IL-24(50 pg/L)并不能完全抑制体外培养的鼻咽癌细胞株CNE-2Z的增殖，可能与鼻咽癌的病因、发病机制复杂有关。Yang等［15］报道，IL-24浓度为50 pg/L时，可明显抑制A549细胞增殖，与本实验结果相似。Cheng等［16］报道，IL-24可诱导体外培养的急性白血病核细胞凋亡，在培养的48 h，可见到DNA出现梯形条带，该时间窗与本实验相似，具体机制有待进一步探索。本实验为今后鼻咽癌研究和治疗提供了实验依据和研究思路。

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