董钊,姜磊,于生元

电刺激大鼠上矢状窦旁硬脑膜后血浆降钙素基因相关肽和P物质的变化

董钊,姜磊,于生元

目的观察电刺激上矢状窦旁硬脑膜对大鼠血浆降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质浓度的影响。方法13只大鼠随机分为对照组(n=6)和电刺激组(n=7)。对照组行假刺激,电刺激组以20 Hz、4 mA和250 μ s的方波电流刺激上矢状窦旁硬脑膜,使用放射免疫法比较血浆CGRP和P物质的浓度。结果对照组与电刺激组的血浆CGRP浓度相比有显著性差异(50.60±7.16 pg/ml vs 42.20±4.82 pg/ml,P=0.029),而血浆P物质浓度相比无显著性差异(308.59±43.07 pg/ml vs 264.60±60.28 pg/ml,P=0.165)。结论电刺激上矢状窦旁硬脑膜能够降低大鼠血浆CGRP浓度,而P物质浓度无明显变化。

电刺激;上矢状窦;降钙素基因相关肽;P物质;大鼠

降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)和P物质(substance P,SP)是在人类偏头痛发病机制中起着重要作用的两种肽类物质。我们在前期研究中利用电刺激大鼠上矢状窦(sinus sagittalis superior,SSS)旁硬脑膜的方法建立了一种新的偏头痛动物模型[1],并从行为学、微循环和组织学证实此模型的可行性[1-4]。本实验将利用此方法研究大鼠血浆中CGRP和SP的变化,从神经递质水平进一步阐明偏头痛的发病机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠13只,由解放军总医院实验动物中心提供,体重280～320 g,平均(300±20)g,随机分为手术对照组(n=6)和电刺激组(n=7)。

1.2 主要试剂与仪器 10%EDTA、抑肽酶、CGRP放免试剂盒均由解放军总医院东亚放免研究所提供。电刺激器(型号:SEN-7103):日本光电工业株式会社;分离器(型号:SS-102J):日本光电工业株式会社;台式牙钻床(型号:307-6):上海齿科器械厂;金属电极:北京东恒宇技术开发中心;冷冻离心机(型号:DDL-5):上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备 大鼠用10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔麻醉成功后,头正中部剪掉毛发,固定于立体定位仪上,消毒皮肤,逐层切开皮肤、肌肉,分离骨膜后彻底暴露颅骨,以颅中线冠状缝交叉点前4 mm为前界,交叉点后6 mm为后界,用台式牙科钻钻开两个直径约1 mm的圆孔,钻孔时间断使用4℃生理盐水以降低钻头及孔的温度,以防灼伤硬膜,在剥离颅骨骨片时需注意勿划破硬膜及SSS。以上所有操作均在无菌条件下进行,整个操作过程保持轻柔、安静,避免强光,室温保持25℃左右。

1.3.2 电刺激方法 将金属电极一前一后放置于刺激孔之上硬脑膜,应用刺激器和分离器行电刺激5 min,刺激参数为:频率 20 Hz 、脉宽 250 μ s、强度 4 mA。

1.3.3放射免疫法测定血浆CGRP和SP含量 将大鼠于刺激结束后马上开胸并暴露心脏,以10 ml注射器从心尖部位抽取全血4 ml,去掉针头,缓慢注入含有10%EDTA 60 μ l和抑肽酶 80 μ l的无菌离心管中 ,轻轻混匀后立即4℃3000 r/min离心20 min,在整个处理过程中防止溶血,吸上清液分装于两个EP管中,加盖存-80℃冰箱待测。集中测定前,使样本置于冷水复融,再次 4 ℃3000 r/min离心 5 min,取上清液,按放免试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学分析 SPSS 13.0统计学软件行独立样本t检验。

2 结果

2.1 血浆CGRP浓度 对照组和电刺激组分别为(50.60±7.16)pg/ml和(42.20±4.82)pg/ml,两组间差异有统计学意义(P=0.029)。见图1。

2.2 血浆SP浓度 对照组和电刺激组分别为(308.59±43.07)pg/ml和(264.60±60.28)pg/ml,两组间差异无统计学意义(P=0.165)。见图2。

图1 对照组和电刺激组的血浆CGRP比较

图2 对照组和电刺激组的血浆SP比较

3 讨论

CGRP是一种由37个氨基酸组成的生物活性多肽,在神经系统中以脊髓含量最高,特别是背侧角、背根神经节及三叉神经节。CGRP发挥生物学效应可能的途径为其可与平滑肌受体结合,激活腺苷酸环化酶,使细胞内cAMP浓度升高,进而作为第二信使促进Ca2+从胞浆摄入至细胞内的膜结构中,阻断Ca2+向细胞内流动,引起细胞内Ca2+浓度下降,最终导致钙调蛋白形成肌球蛋白轻链激酶,使肌动球蛋白的ATP酶激活发生障碍,产生扩血管效应。另一方面,通过cAMP依赖的蛋白激酶作用,使肌球蛋白的轻链激酶失活,引起扩血管效应。它是迄今已知最强大的血管舒张肽,在疼痛感觉和调控中也有重要作用[5-6]。

偏头痛发病机制中的神经源性炎症假说认为,偏头痛中肽类物质的释放导致以血管扩张、血浆蛋白渗出、肥大细胞脱颗粒等为特征的神经源性炎症。而此过程中与三叉神经血管反射系统最相关的神经肽是CGRP[7]。SP是另一种和三叉神经血管反射激活有关的肽类物质,和神经激肽A、神经激肽B等同属于速激肽类,是初级传入纤维末梢释放的神经递质,在脊髓主要位于背侧角,在脑干主要位于导水管周围灰质、中缝大核、网状巨核细胞等,对伤害性痛觉的传递起着重要作用[8]。

目前关于不同的动物模型及偏头痛患者血浆中CGRP和SP的变化的研究结果尚不完全一致。有研究发现电刺激离体的鼠硬脑膜的5 min刺激期间,CGRP释放增加,在刺激后采样期间恢复至基线水平,而SP却无明显变化[9]。还有研究发现,刺激动物SSS可以导致颈静脉血中CGRP和血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)的升高,而SP和神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)无明显改变[10]。关于偏头痛患者,多数报道认为患者头痛发作间歇期CGRP反应升高,而SP无明显变化[11-13]。但也有研究发现,在偏头痛的头痛缓解后4 d内的周围血样中CGRP与SP是降低的,而且在头痛刚缓解,尚存头部不适患者的CGRP降低更为明显[14]。但同样的研究者在刺激大鼠三叉神经节5 min后发现CGRP和SP的水平均明显升高[15]。

本研究发现,电刺激组较对照组的CGRP血浆水平有所降低,而SP无明显变化。采血样的时机是影响测定结果的重要因素。当头痛发作初始或者刺激正在进行时,这些肽类在神经末梢大量释放,这时血中浓度可升高;在头痛缓解期的某一时程,这些肽类经代谢而降低,而神经末梢处于排空状态时,血中CGRP浓度无法得到适时补充而渐消失。本研究结果提示,CGRP在偏头痛的发病过程中可能有较大的波动,从另一角度支持在头痛期感觉神经末梢释放CGRP的观点[16]。在后续研究中我们将进一步研究在不同时间点这些神经肽类的动态变化,以进一步阐明偏头痛等血管源性头痛的发病机制。

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Changes of PlasmaConcentration of Calcitonin Gene-related Peptide and Substance P after Electrical Stimulation on Dura Mater Adjacent to Sinus Sagittalis Superior in Rats

DONG Zhao,J IANG Lei,YU Sheng-yuan.Departmentof Neurology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China

ObjectiveTo analyze the changes of plasma concentration of calcitonin gene-related peptide(CGRP)and substance P(SP)after electrical stimulation on dura mater adjacent to sinus sagittalis superior(SSS)in rats.Methods13 rats were randomly divided into control group(n=6)and stimulation group(n=7)in which the dura matter adjacent to SSS was stimulated electrically with square wave of 20 Hz,4 mA and 250μ s.The plasma concentrations of CGRP and SP in both groups were compared by means of radioimmunity method.ResultsThere was significant difference in the plasma concentration of CGRP between control and stimulation groups(50.60±7.16 pg/ml vs 42.20±4.82 pg/ml,P=0.029).However,there was no significant difference in the plasma concentration of SP between two groups(308.59±43.07 pg/ml vs 264.60±60.28 pg/ml,P=0.165).ConclusionPlasma concentration of CGRP decreased after electrical stimulation on dura mater in rats but the concentrations of SP unchanged.

electrical stimulation;superior sagittal sinus;calcitonin gene related peptide;substance P;rats

[本文著录格式]董钊,姜磊,于生元.电刺激大鼠上矢状窦旁硬脑膜后血浆降钙素基因相关肽和P物质的变化[J].中国康复理论与实践,2011,17(4):334—336.

解放军总医院神经内科,北京市 100853。作者简介:董钊(1976-),男,河南洛阳市人,博士,主治医师,主要研究方向:头面痛的基础与临床研究。通讯作者:于生元。

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1006-9771(2011)04-0334-03

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·基础研究·