王超,孙天胜,姜京城,叶超群

大鼠颈段红核脊髓束损伤后炎症反应相关基因表达谱

王超,孙天胜,姜京城,叶超群

目的探讨大鼠颈段红核脊髓束(RST)损伤后急性期炎症反应的分子机制。方法Sprague Dawley(SD)雌性大鼠18只,随机分为2组:双侧 RST损伤组(n=9)和假手术对照组(n=9)。制作双侧 RST损伤模型,24 h后处死动物,以损伤处为中心取长约0.5 mm脊髓组织,将各组中的3只动物标本混合,提取总RNA,共得到6份RNA样品,使用含有28000个大鼠基因的 Affymetrix表达谱基因芯片检测基因变化。结果大鼠RST损伤后24 h表达发生变化的有153条基因,表达上调的有136条,表达下调的有17条。与炎症相关的基因大部分表达上调(Scn9α除外),Toll样受体信号途径中有8条基因表达上调。结论RST损伤后多种炎症反应相关的基因表达出现变化。

脊髓损伤;红核脊髓束;基因芯片;大鼠

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后的炎症反应是当前研究的一个热点。各种炎症细胞如小胶质细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和各种细胞因子对SCI的发展各有利弊[1]。SCI可以引起血脊髓屏障的破坏,使免疫细胞从血中进入脊髓。中性粒细胞或巨噬细胞的浸润以及脊髓中的小胶质细胞不利于SCI后的恢复[2-3]。中性粒细胞释放的神经毒性因子包括金属蛋白酶、活性氧自由基和肿瘤坏死因子,巨噬细胞释放的神经毒性因子尚不明确[4]。中性粒细胞和神经元的直接接触也可以增强神经毒性[5],T细胞[6]可以加重轴突的损伤,使轴突脱髓鞘,失去功能。然而另一方面,在SCI后巨噬细胞、小胶质细胞和T细胞也可以分泌一些因子起到神经保护和促进再生的作用[7-8]。这些结论说明,SCI后的炎症反应可能起到双重作用。目前对于神经系统炎症反应相关基因的研究较少。本研究使用基因芯片技术检测大鼠一个下行传导束——红核脊髓束(rubrospinal tract,RST)损伤后24 h炎症反应相关基因的表达变化,从基因水平揭示RST损伤后炎症反应的深层机制,可能会以SCI后的炎症反应作为新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康成年雌性(SD)大鼠18只,体重200～230 g,平均220 g。随机分成两组:双侧RST损伤组和假手术对照组,每组9只。

1.2 RST损伤模型制备 大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液,按0.3 ml/100 g麻醉成功后,俯卧位固定于操作台,外科常规消毒、铺无菌巾,手指触摸确定C2棘突为标志,以C3棘突为中心沿背侧正中线做20～30 m纵向切口,切开皮肤及皮下组织,钝性分离肌肉,暴露C2-4节段椎板,用自制微型咬骨钳从C3-4椎板间隙进钳,轻轻向上咬除整个C3椎板及两侧关节突,严格止血,暴露脊髓硬脊膜及双侧神经根。将大鼠俯卧位固定于立体定位仪上,在冷光源显微镜直视下用显微外科剪剪开脊髓硬脊膜,探查双侧神经根后根,以其为标志,用自制宽度0.6 mm的损伤刀片调整至其腹侧,与立体定位仪水平面呈25°角插入脊髓,深度0.8 mm,为确保损伤完全,反复插入多次并留刀3～5 min,以同种方法损伤对侧RST。拔出刀片,0.9%氯化钠注射液冲洗,严格止血,局部给予适量青霉素后逐层缝合筋膜、皮肤碘附消毒伤口。

1.3 取材及RNA提纯 术后24 h,将各组大鼠麻醉,用0.9%氯化钠注射液200 ml心脏灌流处死。以损伤处为中心,迅速取出长度约5 mm脊髓组织放入冻存管中,将冻存管投入液氮中保存。各组中3只大鼠的样本混合得到一份样品,共得到6份样品。采用 Trizol一步法提取组织中的总RNA,通过醇沉淀法浓缩RNA,并进一步采用Qiagen RNeasy MinElute Cleanup Kit对总 RNA进行过柱纯化,分光光度计定量,1.5%甲醛变性电泳检测RNA,一共得到6份RNA样品。送北京博奥生物有限公司(生物芯片北京国家工程研究中心)进行基因检测。

1.4 数据分析 使用Standford大学开发的基因芯片显著性差异分析 (Significance Analysis of Microarray,SAM)软件筛选差异基因,Fold change＞2.0或＜0.5为表达发生差异的基因。使用博奥生物有限公司提供的分子功能注释系统、GenBank数据库、KEGG数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)、GO数据库(Gene Ontology,基因本体论)对这些差异基因进行分析。

2 结果

2.1 总 RNA提取结果 RNA样品总量≥15 μ g,RNA纯度:A260/280≥1.80,RNA完整性:经甲醛变性胶电泳检测,RNA样品电泳条带清晰,28S∶18S rRNA条带亮度大于或接近1∶1,样品纯度、总量及完整性均符合Affymetrix表达谱芯片检测要求。

2.2 基因芯片分析结果 大鼠颈段RST损伤后24 h表达发生变化的有153条基因,其中表达上调的有136条,表达下调的有17条。使用GO数据库对差异基因进行分析,发现表达发生变化的炎症相关基因大部分为表达上调,仅Scn9α表达下降(表1～表3),Toll样受体(TLRs)信号途径中有8条基因表达发生变化,均为表达上调(表4)。

表1 GO:0006954炎症反应差异表达基因

表2 G O:0030593中性粒细胞趋化差异表达基因

表4 Toll-样受体信号通路差异表达基因

表3 GO:0030595白细胞趋化差异表达基因

3 讨论

SCI后会引起功能受限,甚至残疾,并带来巨大的经济负担。目前对于SCI尚无有效的治疗方法。脊髓独特的构造和功能分布使得局部的损伤可以对肢体远端的功能产生影响。脊髓灰质损伤是节段性的,只局限于损伤节段的灰质支配的区域。而脊髓白质是由上、下行传导束组成的,其损伤可以对损伤节段以下的感觉和运动均产生影响,所以临床症状的影响主要决定于白质中传导束的损伤程度。过去的研究主要使用原位杂交、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫组化等生物技术,在同一时间仅能研究几个基因的变化,不能适应现代高通量的研究要求。本实验使用含有28000个大鼠基因的Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array表达谱芯片对大鼠颈段RST损伤后24 h的基因表达变化进行检测,为进一步阐明传导束损伤后炎症反应的深层机制打下基础。

GO数据库在生物信息学领域中已被广泛使用,被用来解释真核基因及蛋白在细胞内所扮演的角色,它包括3个分支:生物过程、分子功能和细胞组件。将RST损伤后24 h发生的基因表达变化使用GO数据库分析后,发现涉及炎症反应、中性粒细胞趋化和淋巴细胞趋化的基因表达变化,除Scn9α外,其他基因的表达均上调,主要包括多种趋化因子配体如Cxcl10,Cxcl3,Ccl3,Cxcl2,Cxcl1,Ccl7等,以及趋化因子配体Ccr1,其中Cxcl10的上调幅度最大,有的趋化因子在GO数据库中同时参与多种功能。趋化因子在白细胞的迁移中扮演重要角色[9],吸引中性粒细胞、单核/巨噬细胞等炎性细胞移动到病灶,增强炎性细胞的吞噬杀伤功能,促进它们释放炎症介质和炎症蛋白。有文献报道它还在神经系统的发育中起着重要作用[10],神经细胞和胶质细胞在不同的条件下均可以表达趋化因子及其受体,调节发育和突触信号传递。Cxcl10表达上调的程度最高,它的功能[11]包括对单核/巨噬细胞、T细胞、自然杀伤细胞和树突细胞的趋化作用,促进T细胞黏附到内皮细胞,促进血管生成。

T LRs在天然免疫中扮演着重要角色,T LR的激活可以引起炎症反应已经是大家所公认的。最近有研究表明,创伤或缺血后释放的某些内源性因子也可以激活 TLR受体,T LR4可以激活NF k-B信号通路[12],从而启动多种促炎因子的转录,如一氧化氮合酶,环加氧酶,金属蛋白酶9和黏附分子[13]。它可以称为感知组织损伤的哨兵,在损伤引起的局部炎症反应中具有重要作用。使用KEGG对结果进行分析后发现,RST损伤后24 h TLRs信号通路中有8个基因表达上调,其中包括趋化因子 Ccl3、Cxcl9、Cxcl0、Cxcl1,表明在RST损伤后 TLRs信号通路已被激活,趋化因子在TLRs激活的炎症反应中起着重要作用。

本研究结果显示,RST损伤后炎症反应相关基因的变化和T LRs信号通路相关的基因变化。由于基因芯片高通量的特性使其准确性较差,下一步我们将采用RT-PCR技术对这些基因的表达变化进行验证,然后进一步检测其在损伤后不同时间点的表达变化,从而为深入研究脊髓传导束损伤后炎症反应的发生和发展过程打下基础。

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Inflammation Response Related Gene Expression Profile after Injury of Rubrospinal Tract

WANG Chao,SUN Tian-sheng,J IANG Jing-cheng,et al.Department of Orthopedics,Beijing Army General Hospital,Chinese PLA Postgraduate Medical School,Beijing 100700,China

ObjectiveTo investigate the characteristic changes of expression of the genes related to inflammation response after injury of rubrospinal tract(RST).Methods18 Sprague Dawley(SD)female rats were randomly divided into 2 groups:RST injury group(n=9)and Sham group(n=9).RST injury models were established,and the rats were killed 24 hours after injury.5 mm length spinal cord was harvested from the epicenter and total RNA was extracted.Affymetrics Gene Chips for rats,representing 28000 genes,were used for mRNA expression profiling.Results153 transcripts were observed to differ(2.0 fold;136 up-regulated and 17 down-regulated)after injury of RST,compared with sham group.M ost of genes related to inflammation response were upregulated(except Scn9α).8 genes related to Toll-like receptor signaling pathway were also up-regulated.ConclusionSignificant changes related to inflammation response occur in acute phase after injury of RST.

spinal cord injury;rubrospinal tract;gene chip;rat

[本文著录格式]王超,孙天胜,姜京城,等.大鼠颈段红核脊髓束损伤后炎症反应相关基因表达谱[J].中国康复理论与实践,2011,17(4):337—339.

北京军区总医院骨科,解放军军医进修学院,北京市100700。作者简介:王超(1982-),男,山西吕梁县人,在读硕士研究生,医师,主要研究方向:脊髓损伤。通讯作者:孙天胜(1964-),男,河北沧州市人,硕士,主任医师,教授,主要研究方向:脊髓损伤。

R364.5,R744

A

1006-9771(2011)04-0337-03

2011-03-16)

·综述·