赵振峰,王芳,刘宏光,李洪梅,唐强

针康法对局灶性脑缺血大鼠学习记忆能力及海马基质细胞衍生因子-1αmRNA的影响

赵振峰1,2,王芳2,刘宏光2,李洪梅2,唐强2

目的探讨针康法对局灶性脑缺血大鼠学习记忆能力及海马基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)mRNA的影响。方法将60只大鼠随机分为正常对照组组(n=6)、模型组(n=18)、针康组(n=18)和康复组(n=18)。采用光化学法诱导局灶性脑缺血模型,将模型组、针康组和康复组再分为3 d、7 d、14 d 3个亚组。术后24 h对针康组进行头穴丛刺结合水迷宫训练干预,康复组仅进行水迷宫训练,模型组不给予任何干预。采用Y-型迷宫评价大鼠的学习记忆能力,反转PCR(RT-PCR)法观察各组大鼠海马组织中SDF-1αmRNA表达情况。结果术后各时间点,正常对照组、针康组、针康组大鼠学习能力优于模型组(P＜0.05),与康复组比较,针康组术后3 d无显著性差异(P＞0.05);术后7 d、14 d有显著性差异(P＜0.05);与正常对照组比较,模型组、针康组和康复组均有显著性差异(P＜0.05);与模型组比较,针康组、康复组SDF-1 mRNA均有显著性差异(P＜0.05);与康复组相比,针康组SDF-1 mRNA表达较高,术后3 d、7 d显著性差异(P＜0.05),14 d无显著性差异(P＞0.05)。结论针康法能上调局灶性脑缺血大鼠海马SDF-1αmRNA,这可能是其促进局灶性脑缺血大鼠学习记忆能力的提高机制之一。

脑缺血;针康法;学习记忆;基质细胞衍生因子-1αmRNA;大鼠

脑缺血区血管再生的程度和范围直接影响组织血液供应。通过对脑缺血后脑外成血管因素的调动,能够促进脑缺血区血管再生以治疗脑缺血[1],提示加强动员内源性血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)可能成为临床治疗脑缺血的一种有效方法。基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)/CXCR4轴对EPC具有动员、增殖并诱导其归巢至缺血组织区的作用[2]。本实验探讨针康法对局灶性脑缺血大鼠学习记忆能力和海马CA1区SDF-1αmRNA表达的影响,旨在阐明针康法的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠,体重200～250 g,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供(许可证号SCXK(京)2009-0001)。将60只大鼠随机分为4组:正常对照组(n=6)、模型组(n=18)、针康组(n=18)和康复组(n=18)。采用光化学法诱导局灶性脑缺血模型,将针康组、康复组和模型组再分为 3、7、14 d 3个亚组,每组6只。

1.2 主要试剂 ①虎红(四氯四碘荧光素纳)粉剂:国药集团化学试剂有限公司,批号:F20091021;②Real Time PCR:HaiGene,SYBR Green荧光定量试剂盒,由上海西唐生物科技有限公司提供;③水合氯醛:国药集团化学试剂有限公司,批号20080319;④Trizol:Invitrogen Corp.,USA;⑤cDNA第一链合成试剂盒:HaiGene Corp.,China,引物由上海生工公司合成。

1.3 主要仪器 ①冷光源由哈尔滨工业大学研制,激光为发光光源,滤去全部紫外线与红外线,投射出单一绿光束,波长为(530±30)nm;②Morris水迷宫:华北正华生物仪器设备有限公司;③荧光定量 PCR仪ABl7500:ABI Corp.,USA。

1.4 模型制备 采用光化学诱导法[3]:大鼠用10%水合氯醛按35 mg/kg常规麻醉后,将其俯卧于脑立体定位仪上,沿头颅正中切开头皮暴露颅骨,在前囟后3.5 mm、中线向左旁开2 mm处,用牙科钻轻轻钻一个直径约1 mm的骨窗,光纤管尾端至硬膜下3.5 mm。虎红按70 mg/kg于腹腔注射,注射时间1.5 min。5 min后通过光纤管照射局部海马组织。照射时间:5 min。术后缝合头皮,正常喂养。1.5干预方法

1.5.1 针康组 术后24 h进行针康法干预,按“大鼠穴位图谱”所示,取百会穴及百会左、右侧各旁开2 mm处针刺(应用头穴丛刺针法),快速捻转1 min后留针2 h,在留针期间进行Morris水迷宫训练,每天1次。

Morris水迷宫训练:从站台所占象限外的另三个象限随机选择一个入水点,将大鼠面向池壁放入池中,观察并记录大鼠寻找并爬上平台的潜伏期。如2 min内找不到站台,则将其在站台上放置30 s后再放回笼中,此时潜伏期记为120 s。训练时分别从3个不同的入水点入水,每次不同动物的入水点相同,训练顺序固定。

1.5.2 康复组 术后24 h仅给予水迷宫训练,方法同上。

1.5.3 模型组 术后不进行任何处理,自然恢复。

1.5.4 正常对照组 不进行任何处理。

1.6 学习记忆能力评估 Y-型迷宫为一个三等臂式迷宫,每臂顶端设一信号灯,信号灯亮后6 s,此臂即为危险区,通以36 V交流电,刺激大鼠从所在的亮臂跑到暗臂。训练中始终有一臂为安全区,安全区按无规则的次序变换。如果大鼠在通电后从所在亮臂跑到另一亮臂记为错误,跑到暗臂则为正确。1 d内连续分段训练大鼠,每10次为1段,两段间大鼠休息2 min。记录大鼠掌握迷宫结构(续10次测试中有9次正确即为掌握迷宫结构)所需的训练次数,训练次数越少,表明大鼠学习能力越强。以此作为判断大鼠学习分辨能力的指标。

1.7 标本采集及指标检测 行为学检测完毕,断头取

脑组织,生理盐水冲洗,取海马迅速投入-80℃液氮中保存备用。(注:正常对照组于第3天断头)

1.7.1 总RNA提取 组织于液氮条件下研磨粉碎,取100 mg装入1.5 ml EP管中;向每管中加入Trizol试剂1 ml;用移液枪反复吹吸,直至裂解液中无明显沉淀,室温静置 5 min;向上述裂解液中加入 200 μ l氯仿,盖紧离心管盖,用力震荡15 s,待充分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后,室温静置5 min;12000 g 4℃离心15 min;从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为3层,即:无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中;向上清液中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后20℃室温静置10 min;12000×g 4℃离心10 min;小心弃去上清,缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1 ml(切勿触及沉淀),轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁。2℃～8℃12 000 g离心5 min,弃上清;室温干燥沉淀 5 min,加入 100 μ l无 RNase的水,55℃～60℃放置10 min完成RNA提取。用琼脂糖凝胶电泳法检测 RNA的完整性,紫外线分光光度计测定A260和 A280的 OD值,求出A260/A280的比值,要求比值在1.8～2.0之间。

1.7.2 反转录反应 在PCR管中配制混合液,在PCR仪上进行以下反应:65℃5 min,然后置于冰上急冷。在PCR管中加入反转录反应液,在PCR仪上进行反转录反应。

1.7.3 Real Time PCR引物 参照PubMed基因库提供序列,SDF-1αmRNA序号NM-022177.3,设计出引物,并由上海生工公司合成。SDF-1α mRNA(123bp)引物上游序列5'-GCATCAGTGACGGTAAGC-3',下游引物序列 5'-GAAGGGCACAGTT TGGAG-3'。

1.7.4 SDF-1αmRNA水平分析 用 Quantity One 4.40版软件分析产物条带,SDF-1αmRNA与内参βactin的累积光密度值比值即为其mRNA相对值。

1.8 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析,P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 学习记忆能力评估 Y-迷宫试验结果显示,术后各时间点,正常对照组、针康组、针康组大鼠学习能力优于模型组(P＜0.05),与康复组比较,针康组术后3 d无显著性差异(P＞0.05),术后7 d、14 d有显著性差异(P＜0.05)。见表1。

2.2 RT-PCR检测海马SDF-1 mRNA的表达 与正常对照组比较,模型组、针康组和康复组均有显著性差异(P＜0.05);与模型组比较,针康组、康复组均有显著性差异(P＜0.05);与康复组相比,针康组 SDF-1 mRNA表达较高,术后 3 d、7 d显著性差异(P＜0.05),14 d无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表1 各组大鼠不同时间点学习记忆能力比较(次)

表2 各组大鼠不同时间点海马CA1区SDF-1 mRNA检测结果(相对值)

3 讨论

许多研究表明,成年动物(包括人)的中枢神经系统内存在具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞。正常情况下,它们处于静息状态,只有在一定的信号刺激下才能被激活。脑缺血时,大脑皮层、海马、脑室下区等区域的神经干细胞能够增殖、迁移和分化成为神经元和胶质细胞[4-5],而且新生神经元能够部分替代受损的神经元及其功能。脑缺血后给予头穴丛刺[6]和康复训练能够促进内源性神经干细胞的激活,导致神经系统的自身修复能力增强,从而促进机体的康复[7]。

SDF-1α是CXC趋化因子家族成员之一,是为数不多的表达于脑组织中的趋化因子之一。在正常神经系统中,SDF-1α量维持在较低水平,不发挥迁移趋化作用。有研究表明,以SDF-1为代表的趋化因子可能在神经干细胞的定向迁移过程中发挥着重要作用[8]。当中枢神经系统发生缺血和缺氧等病变后,可引起SDF-1α水平的上调,趋化血液系统中的单核、巨噬细胞向损伤区迁移并发挥相应生物学效应在体内,SDF-1α广泛表达在各种器官和组织中。当SDF-1α与其特异性受体CXCR4结合后,与CXCR4相连的G蛋白被激活,并进一步激活下游的一系列信号转导分子,从而使细胞骨架发生改变,引起细胞迁移、黏附,并调节细胞增生和分化。此过程在体外已被证实[9]。Robin[10]发现缺血半暗带区域的SDF-1α水平升高,水平升高的SDF-1α会作为一种趋化因子吸引内源性神经干细胞移行到受损的部位,并黏附归巢于此处。

本实验以光化学法诱导局灶性脑缺血模型,研究针康法对SDF-1αmRNA的表达影响。结果显示,脑缺血后,缺血区脑组织释放出大量SDF-1α,第3天表达开始增加。针康组在各个时间点SDF-1αmRNA的表达较模型组高(P＜0.05)。提示针康法可促进局灶性脑缺血大鼠海马SDF-1αmRNA的表达。以往研究也表明,电针能通过上调局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血区大脑皮质SDF-1αmRNA及蛋白质的表达而促进缺血区大脑皮质血管再生[11]。

本次实验发现,局灶性脑缺血大鼠进行针康法、康复组干预后,Y-迷宫试验评定学习记忆能力较模型组明显改善,与海马SDF-1αmRNA表达增加相一致,但针康组优于康复组。提示针康法促进局灶性脑缺血大鼠学习、记忆的改善,可能与海马SDF-1αmRNA表达增加有关。

对脑缺血大鼠针康法干预后海马SDF-1αmRNA表达变化的研究将有助于从分子水平阐明神经可塑性机制,为寻找有效的治疗方法提供新的思路,对于深入地了解中枢神经系统的自我修复能力具有重要的意义,并为脑缺血的临床康复提供了一定的理论基础。

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Effect of Cluster Needling of Scalp Acupuncture Combined with Rehabilitation on Learning and Memoryand HippocampusStromal Cell-derived Factor-1αmRNA in Rats after Focal Cerebral Ischemia

ZHAO Zhen-feng,WANG Fang,LIU Hong-guang,et al.Department of Rehabilitation Medicine,the 5nd Hospital af filiated to Harbin Medical University,Harbin 163000,Heilongjiang,China

ObjectiveTo investigate the effect of cluster needling of scalp acupuncture combined with rehabilitation(Tang's Approach)on learning and memory and hippocampus SDF-1αmRNA in rats after focal cerebralischemia.Methods60 rats was randomly divided into 4 groups:the controlgroup(n=6),the model group(n=18),the acupuncture with rehabilitation group(n=18)and rehabilitation group(n=18).Photochemical activity was adopted to induce focal cerebral ischemia model.The acupuncture with rehabilitation group,the model group and rehabilitation group was divided into 3 subgroups by 3,7,14 days.24 hours after molded,the cluster needle of scalp point with Water maze training was used in the acupuncture with rehabilitation group,Water maze training was used in the rehabilitation group,but the model group did not intervene.The learning and memory in rats was evaluated by Y-maze,and the expression of hippocampus SDF-1αmRNA was observed by RT-PCR method on 3th,7th,14th day after infarction.ResultsOn 3th,7th,14th day after infarction,the scores of learning and memory in other groups was less than the control group(P＜0.05),but the learning and memory in the acupuncture with rehabilitation group had been restored,and the difference was statistically significant compared with rehabilitation group(P＜0.05)on 7th,14th day after infarction;the expression of hippocampus SDF-1αmRNA has been risen in the acupuncture with rehabilitation group compared with the rehabilitation group(P＜0.05),but the difference was not significant on 14th day after surgery(P＞0.05).ConclusionThe hippocampus SDF-1αmRNA after focal cerebral ischemia increases by the cluster needle of scalp point with Water maze training,which may be one of the mechanisms to improve the learning and memory by Tang's Approach after focal cerebral ischemia.

cerebral ischemia;Tang's Approach;learning and memory;stromal cell-derived factor-1αmRNA;rats

[本文著录格式]赵振峰,王芳,刘宏光,等.针康法对局灶性脑缺血大鼠学习记忆能力及海马基质细胞衍生因子-1αmRNA的影响[J].中国康复理论与实践,2011,17(4):307—309.

1.哈尔滨医科大学附属第五医院康复医学科,黑龙江大庆市 163000;2.黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨市 150040。作者简介:赵振峰(1965-),男,黑龙江明水县人,博士研究生,教授,主任医师,主要研究方向:神经康复。通讯作者:唐强(1963-),教授,博士生导师,主要从事神经系统疾病中医康复方法研究。

R245,R49,R743.3

A

1006-9771(2011)04-0307-03

2011-03-16)

·专题·