王 壮 ，刘 富 ，纪 慧 ，田 华

1.齐齐哈尔医学院成人及继续教育学院学工办，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院解剖教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006；3.齐齐哈尔医学院基础医学院办公室，黑龙江齐齐哈尔 161006；4.齐齐哈尔医学院药理教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006

近年来，研究细胞膜离子通道活动的主要方法是膜片钳技术，而获得活力好的神经元便成为应用膜片钳技术的重要先决条件。许多离子通道研究是需要单个分散的神经元，人工培养的神经细胞易受培养环境的影响，自身特性改变较大，而急性分离的细胞却能相对保持完好的生理特性[1-3]。笔者结合文献并加以改进，摸索出一种简便易行的适用于全细胞膜片钳研究的大鼠顶叶皮层神经元急性分离方法，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠，10～16 d，雌雄不限，由哈尔滨医科大学附属二院动物研究中心提供。

1.2 试剂

胰蛋白酶(Protease)、四乙胺(TEA)、4-氨基 吡啶(4-AP)、EGTA、HEPES、CsCl，均为 Sigma 公司产品，其余为国产分析纯试剂。

1.3 大鼠皮层神经元的急性分离

断头取大脑皮层，切成厚约0.4 mm的冠状脑片，置于通有95%O2和5%CO2混合气体的人工脑脊液[ACSF（mmol/L）：NaCl 142， KCl 5， CaCl22， MgSO42， D-Glucose 10， HEPES 10，pH 7.3，32℃]中孵育1 h后，再在通有95%O2和5%CO2混合气体的0.1%胰蛋白酶（用ACSF配制）溶液中消化30 min。消化好的脑片以ACSF冲洗、剪碎，以尖端抛光的Pasteur吸管（口径分别为 500、300、150 μm）依次吹打，使组织块分散，吹打成细胞悬液，静置2～4 min后，吸取上清液，滴于有饱和氧细胞外液（mmol/L，NaCl 130、KCl 5.4、CaCl21、MgCl21、Glucose 25、HEPES 10、CdCl20.2，pH7.3） 的培养皿中， 静置20 min细胞贴壁后进行膜片钳实验。整个实验在20～25℃下进行。

1.4 全细胞记录方

对神经元电生理的膜片钳研究，要求细胞的膜光滑完整、清洁、状态良好，破膜后对其细胞活性仍能保持很长一段时间[4]。……