张小菊 王 荔 高建英

山西医科大学第二附属医院神经内科 太原 030001

塞来昔布对高脂血症大鼠脑缺血再灌注后MMP-9和COX-2表达的影响▲

张小菊 王 荔△高建英

山西医科大学第二附属医院神经内科 太原 030001

目的观察塞来昔布对高脂血症(hyperlipidem ia,H L)大鼠脑缺血再灌注损伤后基质金属蛋白酶-9(metalloproteinase-9,MMP-9)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表达的影响。方法健康雄性Wister大鼠 70只随机分为 4组：正常假手术组(S组)10只、正常缺血再灌注组(nIR组)20只、高脂缺血再灌注组(h IR组)20只和高脂缺血再灌注塞来昔布干预组(C+hIR组)20只。后3组又分为缺血1 h再灌注12 h、24 h、48 h 3个时间点。采用高脂饮食建立高脂血症大鼠模型,应用线栓法制做大鼠大脑中动脉栓塞模型。用免疫组化法检测脑组织MMP-9、COX-2的表达,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色测定梗死灶体积。结果在同一缺血再灌注时间点,与n IR组比较,hIR组、C+h IR组脑组织MMP-9、COX-2表达明显增高(P＜0.01),h IR组梗死体积增大具有统计学意义(P＜0.01),C+hIR组梗死体积增大具有统计学意义(P＜0.05);与hIR组相比,C+h IR组脑组织MMP-9、COX-2表达下降、梗死体积减小(P＜0.01),脑缺血再灌注后脑组织中MMP-9、COX-2的表达有显著的相关性(r=0.835)。结论高脂血症合并脑缺血再灌注损伤病理过程中炎症反应起重要作用。塞来昔布对高脂脑缺血再灌注大鼠COX-2、MM P-9的过度表达产生抑制作用,干预炎症反应减轻脑缺血再灌注损伤。

高脂血症;脑缺血再灌注损伤;基质金属蛋白酶-9;环氧化物酶-2;塞来昔布

在脑缺血的病理生理过程中,脑缺血后的炎症反应日益受以重视,最初脑损害是由于血供障碍缺氧造成的,随后由于缺血缺氧所继发的系列级联反应所引发。炎症在这众多级联损害中起重要作用,尤其再灌注后炎症反应进一步加剧脑缺血损伤,阻断再灌注后炎症级联反应是改善缺血后继发性脑损伤的理想策略。

临床上有相当比例的脑梗死患者合并有高血脂症,高胆固醇血症已是脑卒中的危险因素,本实验采用高脂饮食制作高脂血症大鼠模型,从脑缺血再灌注损伤发生后的细胞炎性损伤入手,利用塞来昔布干预高脂血症大鼠脑缺血再灌注模型,探索其作用机制,拟为寻求临床上的脑保护治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物与实验分组 健康雄性Wistar大鼠70只,体质量(110±10)g,4～5周龄(山西医科大学生理教研室提供)。实验分组：先随机分为2组：普通饲料喂养组30只及高脂饲料喂养组40只。以上大鼠同期喂养8周后,普通饲料喂养组随机分为2组：假手术组(S组)10只和正常缺血再灌注组(n IR组)20只;高脂饲料喂养组随机分为2组：高脂缺血再灌注组(h IR组)20只和高脂缺血再灌注缺血塞来昔布干预组(C+h IR组)20只。后3组并随机分为3个亚组：分别于缺血1 h再灌注后 12 h、24 h、48 h处死,各亚组分别有 5、10、5只大鼠。假手术组仅取24 h时间点作为对照。高脂缺血再灌注塞来昔布干预组缺血1 h后给予生理盐水新鲜配置的塞来昔布悬液25 mg/kg灌胃(其他各组在缺血后1 h后给予等量生理盐水灌胃)。各亚组及假手术组取5只行免疫组化染色,仅取24 h时间点5只大鼠行 TTC染色。

1.2 动物模型制备 首先建立高脂血症模型：给予高脂饲料喂养。连续喂养大鼠8周,断尾取血2m L,用于检测血脂四项。血脂测定与同期普通饲料喂养大鼠的血脂差异具有统计学意义(P＜0.05)。脑缺血再灌注模型制备：采用改良的Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(m idd le cerebral artery occlusion,MCAO)模型,假手术组操作过程同上,但栓线插入深度＜10 mm。取神经功能缺损评分为1～3分的大鼠作为研究对象。

1.3 脑梗死体积比测定 各实验组各取5只成膜大鼠再灌注24 h断头取脑。将鼠脑置于-20℃冰箱20 m in使之发硬,再将其切成5等份冠状位切片,置于2%TTC溶液中,37℃水溶,10%甲醛液固定。通过图象分析系统进行切片梗死体积及全脑梗死体积计算,各样本以梗死体积/全脑体积比作统计数据。

1.4 免疫组化测定 灌注后开颅取脑制成蜡块,连续切片,光镜下观察胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。每只大鼠取4张连续切片,在400倍光镜下每张组织切片在缺血侧随机选4个不重复视野,采用图像分析系统测定每只动物MMP-9、COX-2阳性细胞的平均光密度值取平均值作为统计参数。

1.5 统计学分析 实验数据计量资料用均数±标准差表示,用SPSS13.0统计软件包进行t检验和单因素方差分析。相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为有统计学意义。

2 实验结果

2.1 塞来昔布对局灶性脑缺血大鼠梗死灶体积的影响 假手术组大鼠脑组织无梗死灶,呈均匀一致的红色。余各组大鼠脑组织均显示不同范围的苍白色梗死灶,n IR组、h IR组梗死体积比分别为(20.68±1.09)和(32.13±1.22)%,与 nIR组相比,h IR组脑梗死灶体积增大(P＜0.01);C+h IR组梗死体积比为(24.03±1.35)%,与h IR组相比梗死体积减小(P＜0.01),与 nIR组相比梗死体积增大(P＜0.05)。

2.2 再灌注后不同时间点各组大鼠脑组织中M MP-9的表达 见表1、图1A～图1C。免疫组化显示,S组脑组织中可见少量淡染的棕黄色MMP-9阳性细胞,散在分布于大脑皮质、海马区域。再灌注12 h,缺血侧脑组织MM P-9阳性细胞表达增多,颜色增强。再灌注24 h MMP-9阳性细胞表达达高峰,48 h表达下降,但在不同时相MMP-9阳性细胞的形态大小不一致,可在缺血梗死区,梗死灶周围出现,在神经元、星形胶质细胞、内皮细胞、中性粒细胞中见到。同一时间点,与n IR组比较,h IR组、C+h IR组增高(P＜0.01);C+hIR组较h IR组降低(P＜0.01)。

2.3 再灌注后不同时间各组大鼠脑组织中COX-2的表达

见表2、图 1D～图 1F。COX-2阳性细胞呈棕黄色。S组COX-2阳性神经元散在于大脑皮质,海马区,数量极少,再灌注12 h组在缺血侧额顶叶皮层可见大量棕黄色淡染阳性细胞。再灌注24 h,缺血边缘区相当于缺血半暗带区可见大量COX-2阳性表达,颜色增强,COX-2阳性细胞表达达高峰。48h表达下降,与n IR组比较,h IR组、C+h IR组表达明显增高(P＜0.01),C+h IR组较hIR组明显降低(P＜0.01)。

表1 缺血再灌注不同时间点各组MMP-9阳性细胞的平均吸光度值 (±s)

表1 缺血再灌注不同时间点各组MMP-9阳性细胞的平均吸光度值 (±s)

与nIR组比较,▲P＜0.01;表示与 h IR组比较,★P＜0.01;S组与其余各组比较,■P＜0.01;-表示未做检测

组别 n 再灌注12 h组再灌注24 h组再灌注48 h组S 组 5 - 0.188±0.021■ -nIR 组 5 0.304±0.019 0.341±0.022 0.282±0.024 hIR 组 5 0.357±0.031▲ 0.424±0.02▲ 0.339±0.014▲C+h IR 组 5 0.323±0.152▲★ 0.365±0.021▲★ 0.302±0.013▲★

表2 缺血再灌注不同时间点各组COX-2阳性细胞的平均吸光度值(±s)

表2 缺血再灌注不同时间点各组COX-2阳性细胞的平均吸光度值(±s)

与n IR组比较,▲P＜0.01;与 h IR组比较,★P＜0.01;S组与其余各组比较,■P＜0.01;-表示未做检测

组别 n 12 h组 24 h组 48 h组S 组 5 - 0.174±0.023■ -nIR 组 5 0.233±0.013 0.299±0.025 0.223±0.011 hIR 组 5 0.289±0.010▲ 0.365±0.034▲ 0.269±0.02▲C+h IR 组 5 0.254±0.017▲★ 0.323±0.021▲★ 0.248±0.014▲★

2.4 脑缺血再灌注后脑组织 MMP-9与COX-2表达相关性分析,两者表达具有显著正相关性,差异有统计学意义(r=0.835,P＜0.01)。

3 讨论

MMP-9是基质金属蛋白酶系(MMPs)中的一员,是一种依赖锌离子的金属蛋白酶,主要功能是降解和重塑ECM。缺血脑组织受到炎症刺激使星形胶质细胞、小胶质细胞、巨噬细胞等多种细胞分泌MMP-9。脑缺血后MMP-9可降解基底膜的主要成分,如Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白,导致血管完整性破坏,血脑屏障破坏,脑水肿形成以及在继发性脑损伤过程中发挥关键性作用[1]。

COX-2是花生四烯酸代谢过程中最重要的限速酶。在大多数正常组织内检测不到,可以被生长因子、细胞因子或其他的炎症介质所诱导。脑组织在正常情况下可少量表达COX-2,Yokota等[2]对大鼠脑缺血再灌注模型的研究显示,缺血后30m in,COX-2m RNA在半暗带和未受损的扣带回表达增强,24 h时与缺血中心区比较,仍维持较高水平。多年的研究证实,环氧化酶激活是脑缺血性脑损伤过程中触发和促进炎症反应的关键因素之一,COX-2是炎症所致细胞毒性的关键因子。

该研究结果显示,脑缺血再灌注后,缺血脑组织中炎性因子MMP-9和COX-2表达水平明显增高,在缺血再灌注24 h表达高峰,与以往研究结果相一致[3-4],且可以证实脑缺血再灌注大鼠脑组织存在明显的炎性反应。hIR组与n IR组比较,两者表达水平明显升高,梗死体积增大。表明高脂血症大鼠发生脑缺血再灌注后,炎症反应加重,从而加重脑缺血再灌注后损伤。研究表明,动脉粥样斑块中COX-2能够促进炎症细胞合成与释放MMPs,COX-2及前列腺素产物能活化MMPs[5]。孙春雷[6]等研究发现乳腺癌组织中COX-2和MMP-9蛋白高表达,且两者具有显著正相关性,过度表达的COX-2,促进了PGE2合成,从而刺激MM P-9分泌或者可能直接诱导MMP-9表达上调。该研究发现缺血再灌注组脑组织COX-2与MM P-9表达在时间上是一致的,两者表达呈显著正相关性。从而推测脑缺血再灌注后COX-2表达增加及其产物促使MMP-9表达增加。

减少或抑制COX-2和MMP-9过度产生可能是防治脑缺血再灌注损伤的有效途径,近年的研究发现,在大鼠脑缺血再灌注中,尼美舒利还能够抑制炎性因子MMP-9、MMP-2的表达[7],减少梗死形成,改善神经功能,减轻血脑屏障损坏及水肿,减少白细胞浸润以及具有持久的神经保护作用[8]。在ACS患者中采用选择性COX-2抑制剂塞来昔布干预单核细胞,发现塞来昔布能抑制单核细胞分泌IL-6和MMP-9[9]。该实验结果表明,C+hIR组COX-2和MM P-9表达较hIR组明显下降,梗死体积减小。从而推测塞来昔布作为选择性COX-2抑制剂,可通过抑制高脂脑缺血再灌注损伤中COX-2的表达,进一步抑制MMP-9表达,减轻炎症反应,减小梗死体积,减轻脑缺血再灌注损伤。尽管高脂脑缺血再灌注模型给予塞来昔布干预,但与n IR组相比梗死体积较大,MMP-9、COX-2表达增高差异有统计学意义。表明在高脂血症的基础上发生脑缺血再灌注后,MM P-9、COX-2介导的炎症反应可能在高脂脑缺血再灌注中起重要的作用,其机制有待于进一步研究。

总之,塞来昔布与其他传统非甾体类抗炎药相比,塞来昔布具有特异性抑制COX-2表达的特点,而不影响COX-1活性及其正常的生理功能,塞来昔布的不良反应最小,在塞来昔布使用普通剂量的研究中并未出现心血管事件发生增加[10],并有研究显示塞来昔布能保护血管内皮功能[11],故在临床有着引人注目的应用前景。是否可用于脑梗死的治疗仍需大量的动物及临床实践证明。

[1]王建平,尹帅领,孙东羽.高血糖对缺血再灌注大鼠脑出血中MM P-9及血脑屏障的影响[J].中国实用神经疾病杂志,2007,10(4)：17-19.

[2]Yokota C,Kaji T,Kuge Y,et al.Temporal and topog raphic profiles of cyelooxygenase-2 ex pression during 24 h of focalb rain ishemia in rats[J].Neurosci Lett,2004,357：219-222.

[3]刘晓勇,张世明.大鼠脑缺血再灌注后M MP-9的表达及人工合成E-选择素的干预作用[J].中国临床神经科学,2010,18(2)：119-125.

[4]任占川,郭俊仙,杨迎春.脑缺血再灌注后大脑皮质环氧化酶-2的表达及川芎嗪的干预作用[J].解剖学杂志,2008,31(6)：831-847.

[5]李骊华,雷寒.环氧合酶2及其抑制剂与动脉粥样硬化的研究进展[J].中国老年学杂志,2009,29(17)：2 273-2 275.

[6]孙春雷,王祥军,周士福,等.乳腺浸润性导管癌中 COX-2、MMP-9的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学,2010,18(03)：480-482.

[7]W ang Y,Deng XL,Xiao XH,et al.A non-steroidalanti-inflammatory agent provides significant p rotection du ring focal ischem ic stroke with decreased exp ression of matrixm etalloproteinases[J].Cu rr Neurovasc Res,2007,4(3)：176-183.

[8]Candelario-Jalil E.Nim esu lide as a prom ising neu roprotectant in b rain ischemia：new experim ental evidences[J].Pharm acol Res,2008,57(4)：266-273.

[9]邓平,赵水平,黄红光,等.环氧化酶2在急性冠脉综合征患者外周血单核细胞中的表达及意义[J].中南大学学报(医学版),2005,30(4)：403-405.

[10]M cGettigan P,Henry D.Cardiovascular risk and inhibition of cyclooxygenase：a systematic review of the observationalstudies of selective and nonselective inhibitors of cyclooxygenase 2[J].JAMA,2006,296(13)：1 633-1 644.

[11]Chenevard R,Hu rlimann D,Bechir M,et al.Selective COX-2 inhibition improvesendothelial function in coronary artery disease[J].Circu lation,2003,107(3)：405-409.

山西省高校核科技研究开发项目,编号：20091181△

王荔,山西医科大学第二医院神经内科

Email：w angll1997@163.com

R-332

A

1673-5110(2011)07-0026-04

(收稿2011-01-21)