袁野，王晓燕，杨俊卿，周岐新#

（1.重庆医科大学药学院药理学教研室，重庆市 400016；2.重庆医药工业研究院有限责任公司，重庆市 400061）

尼莫地平对神经元退行性变模型小鼠脑组织中铁离子的影响研究Δ

袁野1＊，王晓燕2，杨俊卿1，周岐新1#

（1.重庆医科大学药学院药理学教研室，重庆市 400016；2.重庆医药工业研究院有限责任公司，重庆市 400061）

目的：探讨尼莫地平对神经元退行性变模型小鼠脑组织中铁离子的影响。方法：取小鼠随机分为假手术组（生理盐水）、模型组（生理盐水）和尼莫地平高、中、低（80、40、20mg·kg－1）剂量组，每组35只，后4组脑室内注射0.25%氯化铝2μL，每天1次，连续5d，建立神经元退行性变小鼠模型，假手术组注射等体积人工脑脊液；5d后各组灌胃给予相应药物，每天2次，连续30d，末次灌胃24h后观察其脑组织的病理学变化，考察海马组织中丙二醛（MDA）、血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白、铝离子和铁离子水平变化。结果：与模型组比较，尼莫地平高剂量组神经元损伤明显减轻，其中MDA、HO-1蛋白和铁离子水平明显降低（P＜0.05）；其余指标及尼莫地平中、低剂量组各项指标均无明显变化。结论：尼莫地平可能通过抑制HO-1蛋白表达维持铁离子代谢平衡，发挥缓解神经元退行性变的作用。

铝；铁；血红素加氧酶；神经元退行性变；尼莫地平；小鼠

神经元退行性变疾病病因复杂，包括基因突变、脑血管疾病、氧化应激和金属离子异常等多种因素。有研究[1]发现，铁离子异常升高与神经元退行性变疾病的进展密切相关。体内铁离子主要来源于食物和血红素降解，其中以血红素降解为主。血红素加氧酶（HO）是血红素降解的限速酶，分为3种亚型，其中HO-1为诱导型酶，在脑内广泛分布，以海马组织为甚，是血红素降解的主要通路[2]。HO-1可催化血红素降解除生成铁离子外，还生成一氧化碳和胆绿素。尼莫地平属于二氢吡啶类钙通道拮抗药，主要用于缺血性脑血管疾病及其并发症的治疗[3]。临床研究[4]证明，尼莫地平可改善轻、中度认知障碍患者的记忆力和专注力，但其作用机制尚待研究。同时，研究[5]发现尼莫地平可抑制HO-1表达。但其能否通过抑制HO-1表达，调节铁离子浓度，发挥抗神经元退行性变作用尚未见文献报道。笔者前期实验[6]已证实铝过负荷致神经元退行性变伴有铁离子浓度异常升高，因此本实验拟采用铝过负荷建立神经元退行性变小鼠模型，探讨尼莫地平对其脑组织中铁离子的影响。

1 仪器与材料

1.1 仪器

电感耦合等离子体原子发射光谱仪（美国PE公司）；3K30型低温超速离心机（美国Sigma公司）；UV-265紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；凝胶成像系统、凝胶图像分析系统、微型印迹电泳转移系统、酶标仪（美国Bio-Rad公司）；超声匀浆仪（德国Roche公司）。

1.2 试药

尼莫地平片（浙江正大青春宝药业有限公司，批号：1007002，规格：每片20mg）；兔抗鼠HO-1多克隆抗体（美国Oncogene公司，批号：sc-136960）；丙二醛（MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A003-2）。

1.3 动物

清洁级NIH小鼠，♂，体重27～29g，由重庆医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（渝）2007-0001。

2 方法

2.1 建模

参照文献[7]方法，取小鼠灌胃4%水合氯醛400mg·kg－1麻醉，俯卧固定，将外径0.6mm、内径0.4mm的不锈钢导管植入左侧脑室（颅骨正中线左侧1.3mm，前囟后方0.3mm，深度2.0mm），手术全程动物肛温保持在（36±0.5）℃，手术7d后脑室内注射0.25%氯化铝2μL，每天1次，连续5d，建立神经元退行性变模型。

2.2 分组与给药

根据人用药剂量换算，取175只小鼠随机分为假手术组（生理盐水）、模型组（生理盐水）和尼莫地平低、中、高（20、40、80mg·kg－1）剂量组，每组35只。后4组小鼠按“2.1”项下方法建模，假手术组脑室内注射相同剂量的人工脑脊液；5d后各组灌胃给予相应药物，每天2次，连续30d。

2.3 组织病理学分析

末次灌胃24h后，以4%水合氯醛麻醉小鼠，经左心室快速滴入肝素化磷酸缓冲液50mL，再缓慢滴入4%多聚甲醛50mL，同时剪碎肝脏作为血液和灌注液出口。之后快速分离各组小鼠脑组织，于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切冠状切片，切片厚8μm，常规苏木精-伊红（HE）染色，光镜下进行组织病理学观察。

2.4 海马组织中MDA含量的检测

采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法，分离各组小鼠的海马组织，制备10%组织匀浆。取10%组织匀浆液0.1mL，加入硫代巴比妥酸，充分混匀，100℃水浴40min，冰浴终止反应，于532nm波长处测定光密度（OD）值。以四乙氧基丙烷作为标准品制备标准曲线，根据标准曲线计算丙二醛（MDA）含量。

2.5 海马组织中HO蛋白表达的检测

采用蛋白质印迹（Western blot）法，冰面分离各组小鼠的海马组织，按照100mg组织∶1mL裂解液（10mmol·L－1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液（Tris-HCl），0.15mol·L－1氯化钠，1%乙基苯基聚乙二醇，1%脱氧胆酸，0.1%十二烷基磺酸钠，1mg·L－1亮抑酶肽，1mg·L－1乙酰抑胃肽，1mg·L－1抑肽酶，10%苯甲基磺酰氟）的比例混合，4℃冰浴匀浆，超声破碎，15000r·min－1离心30min，取上清液按二喹啉甲酸法蛋白定量，把蛋白质样品调成1mg·mL－1备用。取蛋白样品（40μg总蛋白/泳道），12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（积层胶20mA，分离胶100V）后电转移至二氟化树脂膜上，5%脱脂奶粉封闭2h，按1∶200的浓度加入HO-1和β-肌动蛋白（β-actin）一抗，37℃孵育2h，漂洗3次，每次5min。按1∶5000的浓度加入二抗，37℃孵育1h，漂洗5次，每次5min，化学发光试

所有实验结果用±s表示，采用SPSS 12.0统计软件进行单因素方差分析，组间比较用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。剂反应2min，凝胶成像系统摄像，采用Quantity One图像分析软件进行图像分析。以HO-1灰度值与β-肌动蛋白灰度值比值表示蛋白表达水平，比值越大，则蛋白表达越高。

2.6 海马组织中铁离子和铝离子水平的检测

采用电感耦合等离子体原子发射光谱法，将各组小鼠海马组织置于1.0mL浓硝酸中，室温消化1h，放入65℃烤箱，4h后加入5mL去离子水，1800r·min－1离心5min，取上清液，分别于238.2、309.27nm波长处检测铁离子和铝离子水平。

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 组织病理学结果

与假手术组比较，尼莫地平低、中、高剂量组和模型组均可见不同程度CA1区神经元形态改变、核染色加深、核固缩，其中模型组最严重，尼莫地平中、低剂量组次之，尼莫地平高剂量组最轻；模型组还可见细胞层次减少、排列紊乱，海马组织正常结构毁损。各组小鼠海马组织病理学变化详见图1。

图1 各组小鼠海马组织病理学变化图A.假手术组；B.尼莫地平高剂量组；C.尼莫地平中剂量组；D.尼莫地平低剂量组；E.模型组Fig1 Pathological change of hippocampus in mice of each groupA.sham operation group；B.nimodipine high-dose group；C.nimodipine medium-dose group；D.nimodipine low-dose group；E.model group

3.2 海马组织中MDA含量的变化

与假手术组比较，模型组和尼莫地平低、中、高剂量组小鼠MDA含量均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，尼莫地平高剂量组小鼠MDA含量明显降低（P＜0.05），尼莫地平中、低剂量组无显著差异，具体结果见表1。

表1 各组小鼠海马组织中MDA和HO-1蛋白水平比较（±s，n＝5）Tab1 Comparison of the levels of MDA and HO-1protein expression in hippocampus in mice of each group（±s，n＝5）

表1 各组小鼠海马组织中MDA和HO-1蛋白水平比较（±s，n＝5）Tab1 Comparison of the levels of MDA and HO-1protein expression in hippocampus in mice of each group（±s，n＝5）

与假手术组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05vs.sham operation group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

组别模型组尼莫地平低剂量组尼莫地平中剂量组尼莫地平高剂量组假手术组MDA/nmol·mg－1 0.717±0.081＊0.723±0.075＊0.551±0.072＊0.397±0.039＊#0.205±0.044HO-1蛋白0.23±0.009＊＊0.25±0.015＊＊0.19±0.012＊＊0.14±0.007＊#0.11±0.010

3.3 海马组织中HO-1蛋白表达的变化

与假手术组比较，模型组和尼莫地平低、中、高剂量组小鼠的HO-1蛋白表达明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，仅尼莫地平高剂量组小鼠的HO-1蛋白表达明显降低（P＜0.05）。各组小鼠海马组织中HO-1蛋白水平比较见表1，电泳结果见图2。

图2 各组小鼠海马组织中HO-1蛋白的表达1.模型组；2.尼莫地平低剂量组；3.尼莫地平中剂量组；4.尼莫地平高剂量组；5.假手术组Fig2 Protein expression of HO-1in hippocampus of mice of each group1.model group；2.nimodipine low-dose group；3.nimodipine medium-dose group；4.nimodipine high-dose group；5.sham operation group

3.4 海马组织中铝离子和铁离子的含量变化

与假手术组比较，模型组和尼莫地平低、中、高剂量组小鼠的铝离子、铁离子含量明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，仅尼莫地平高剂量组小鼠的铁离子含量明显降低（P＜0.05）。各组小鼠海马组织中铝离子和铁离子水平比较详见表2。

表2 各组小鼠海马组织中铝离子和铁离子水平比较（±s，n＝5）Tab2 Comparison of aluminium ion and ferri ion in hippocampus of mice of each group（±s，n＝5）

表2 各组小鼠海马组织中铝离子和铁离子水平比较（±s，n＝5）Tab2 Comparison of aluminium ion and ferri ion in hippocampus of mice of each group（±s，n＝5）

与假手术组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05vs.sham operation group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

组别模型组尼莫地平低剂量组尼莫地平中剂量组尼莫地平高剂量组假手术组铁离子/μg·g－1（组织）54.01±2.31＊＊57.73±3.07＊＊49.42±3.68＊＊36.09±2.85＊#22.54±4.48铝离子/μg·g－1（组织）2.08±0.10＊＊2.03±0.11＊＊2.11±0.08＊＊2.05±0.13＊＊0.35±0.04

4 讨论

有研究[8]证实，铝离子具有神经毒性，铝过负荷可损伤神经突触，导致认知功能障碍。在生理条件下，HO-1具有抗氧化应激作用。在铝过负荷条件下，HO-1过表达是否仍能发挥抗氧化应激尚未见相关报道。但有研究[9]证实，铝离子可阻断铁蛋白的合成，上调游离铁离子水平。因此，在铝过负荷的情况下，尽管HO-1过表达可促进抗氧化剂胆绿素的生成，但铁离子也随之增加，且无法通过合成铁蛋白“解毒”，使得铁离子水平持续升高。与胆绿素被一次性消耗不同，铁离子可反复通过芬顿反应促进自由基生成，导致氧化应激平衡失调。本实验结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠海马组织神经元出现严重损伤，正常结构毁损，其中MDA、铁离子含量、HO-1蛋白表达均明显升高。由此表明，在铝过负荷条件下，HO-1过表达可能通过促进铁离子生成，加剧氧化应激失衡的发展，诱发神经元凋亡。

与模型组比较，尼莫地平高剂量组小鼠的铁离子含量、MDA、HO-1蛋白表达均显著降低，神经元损伤显著缓解，而中、低剂量组无显著变化。表明尼莫地平可能通过抑制HO-1表达，减少铁离子生成发挥抗氧化应激作用，且具有剂量依赖性。由于尼莫地平不能逆转铝离子抑制铁蛋白合成所致的铁离子浓度升高，因此尼莫地平并不能使铁离子完全恢复至正常水平，这可能也是尼莫地平不能完全缓解神经元损伤的原因之一。

综上所述，尼莫地平可能通过抑制HO-1蛋白表达维持铁离子代谢平衡，发挥缓解神经元退行性变作用。

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Effect of Nimodipine on Ferri Ion in Cerebral Tissue of Rats with Neurodegenerative Disease

YUAN Ye，YANG Jun-qing，ZHOU Qi-xin
（Dept.of Pharmacology，School of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）
WANG Xiao-yan
（Chongqing Pharmaceutical Research Institute Co.，Ltd.，Chongqing 400061，China）

OBJECTIVE：To investigate the effect of nimodipine on ferri ion in cerebral tissue of rats with neurodegenerative disease.METHODS：Mice were randomly divided into sham operation group（normal saline），model group（normal saline），nimodipine high-dose，medium-dose and low-dose groups（80，40，20mg·kg－1），with each group of 35mice.The latter 4groups

0.25%aluminum chloride 2μL intracerebroventricularly once a day for five days to induce neurodegenerative model.Artificial cerebrospinal fluid 2μL was injected in the same way in sham operation group.Five days later，all groups were given relevant medicine intragastrically twice a day for 30d.Histological observations was performed 24h after last intragastical injection to evaluate the levels of MDA，Heme oxygenase-1（HO-1），aluminium ion，ferri ion.RESULTS：Compared with model group，neural damage，MDA，HO-1protein and ferri ion level of nimodipine high-dose group were decreased significantly（P＜0.05）.Other index and all index of nimodipine medium-dose and low-dose groups had no different change.CONCLUSIONS：Nimodipine could suppress the neurodegenerative development through inhibiting the expression of HO-1and keeping the balance of ferri ion metabolism.

Aluminum；Ferri；Heme oxygenase；Neurodegenerative disease；Nimodipine；Mice

R338；R743.31；R965

A

1001-0408（2011）17-1553-03

Δ国家自然科学基金资助项目（30672211）

＊主管药师。研究方向：神经药理学。电话：023-63715677。E-mail：yuanyecq@yahoo.com.cn

#通讯作者：教授，博士研究生导师。研究方向：神经药理学。E-mail：cqzhouqx@yahoo.com.cn

2011-01-11

2011-03-10）