曹玲 黎万荣

最近研究表明耳蜗中有大量的一氧化氮合酶(nitric oxide synthease,NOS)存在[1]，提示一氧化氮(NO)在耳蜗内有生物作用。耳蜗内的NO与耳蜗血流调节、内淋巴液离子稳定性和神经传导等生理过程有关，还影响内耳多种疾病的病理生理过程[2]。目前人们对内耳NO及NOS的研究大多仍集中在正常生理情况下的分布和功能特征方面，而对其在内耳病理生理与药理条件下的研究报道尚少见，如NO是否可以通过影响耳蜗外毛细胞表面的钙通道，从而调节外毛细胞的功能状态，影响某些内耳疾病的发生和发展等。本实验应用全细胞膜片钳技术观察NO供体之一L-精氨酸(L-Arg)对豚鼠耳蜗外毛细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响，以探讨NO能否通过耳蜗外毛细胞钙通道途径调节外毛细胞及内耳的功能。

1 材料与方法

1.1耳蜗外毛细胞分离 实验动物为40只杂色或白色豚鼠(由泸州医学院实验动物中心提供)，体重325±22 g，雌雄不拘。动物快速断头处死，取出颞骨，迅速打开听泡，置入已充氧的冷Hanks液中；解剖显微镜下仔细剔除耳蜗骨壳，尽量保持膜迷路完整；断开蜗轴，将耳蜗轻移入含胶原酶Ⅳ的D’Hanks液中消化10～20分钟；轻移入含钙的Hanks液中终止消化5分钟；轻移入预先用多聚赖氨酸处理过的浴槽中，解剖显微镜下微镊撕除螺旋韧带，剪碎基底膜，轻轻吹打后静置10分钟，使单离的外毛细胞贴附于浴槽底部；小心更换新鲜的浴液。选择贴壁良好、立体感强、表面光滑、胞核接近底部、胞内无布朗运动颗粒、胞膜完整有双折射现象的单离外毛细胞进行观察和实验。

1.2实验材料 电极液(mM)：CsCl 119.8， MgCl24.0，EGTA 5.0，CaCl20.06，HEPES 10.0，Na2ATP 3.1， NaGTP 0.42，CsOH调pH至 7.25～7.3。浴液(mM)：NaCl 107.1，CsCl 30.0，MgCl21.8，CaCl21.8， NaHCO34.0， Glucose 5.0，Sodium pyravate 5.0，HEPES 10.0，NaH2PO4·2H2O 0.8，NaOH调pH至7.3～7.4。Hanks液(mM)：KCl 5.4，KH2PO4 0.5 ，NaCl 137.0，NaHCO34.2，Na2HPO40.3， MgCl20.5，MgSO40.4， CaCl21.3，Glucose 5.0，NaOH调pH至7.3～7.4。 D Hanks液(mM)：KCl 5.4，KH2PO4 0.5 ，NaCl 137.0，NaHCO34.2，Na2HPO40.3，NaOH调pH至7.3～7.4。盐桥液同电极液。胶原酶Ⅳ(collagenase Ⅳ)：0.5 mg/ml以上试剂中，HEPES、EGTA、Na2ATP、NaGTP、CsOH、Sodium pyravate、胶原酶Ⅳ均购自美国Sigma公司，L-精氨酸(L-Arg)：C6H14N4O2，Japan，余为国产分析纯。

玻璃微管电极制备:选用内径1.0 mm、壁厚0.25 mm、长度75.0 mm的软质毛细玻璃管 (美国Drummond scientific 公司生产)，置于微管电极拉制仪上，经两步拉制而成，第一步拉制参数设置为58.4 mA，第二步拉制参数设置为53.5 mA，通过两步拉制后的电极尖端直径约为0.7 mm ，充灌电极液后电极阻抗约为5～8 MΩ。将拉制成的微管电极置于抛光仪垂直推进架上，在低倍镜(×60)下找到电极尖端和加热电阻丝，然后换成高倍镜(×495)，将加热电阻丝和电极尖端调整至一个平面内，进行瞬间高温加热，待电极尖端微微回缩后，立即停止加热，完成电极抛光。

1.3ICa-L的记录 采用膜片钳全细胞记录方式(AXOPA TCH-200B Axon instrument,USA)记录不同浓度L-Arg对L型钙通道电流的影响，根据溶液中加入的L-Arg浓度，分为0.5×10-6mol/L组(A组)、1.0×10-6mol/L组(B组)及1.5×10-6mol/L组(C组)，分别观察各组用药后5分钟内 ICa-L峰值电流密度增幅。选择钳制电压(VH)为-60 mV，刺激持续时间为200～300 ms的测试电压，10 mV为一个阶跃，从-50 mV除极到+50 mV，激活钙通道，记录ICa-L。实验中全细胞电流信号经膜片钳放大器放大后，引入记忆示波器及12位A/D、D/A转换器，再输入计算机用于电流信号采集，采样频率为20 kHz。所记录的电流数据采用P-Clamp9.0专用软件进行分析处理，分析电流幅值(current amplitude,Am)、电流密度(current density)和电流-电压关系曲线(I-V)。记录在屏蔽防震工作台上进行。

2 结果

2.1ICa-L的特性及鉴定 图1为豚鼠耳蜗外毛细胞在细胞外液游离钙离子浓度为1.8 mmol/L和Cs+内液时，膜片钳全细胞记录方式下记录到的电流图形。本实验钳制电压(VH)设置为-60 mV，以10 mV为一个阶跃，改变指令电压(VT)(-50 mV～+50 mV)，刺激持续时间为200～300 ms，可记录到一电压依赖性的内向电流。此内向电流的激活电压大于-40 mV～-30 mV，激活范围在-50 mV～+50 mv电压范围内。当VT为0 mV时电流幅值Am达峰值，反转电位约为+60 mV，I-V曲线为钟型。此内向电流具有明显的衰减现象，可被维拉帕米完全阻断。以上结果均提示该内向电流为电压依赖性L型钙通道电流。

图1 膜片钳全细胞记录方式记录到的豚鼠耳蜗外毛细胞ICa-L

2.2L-Arg对耳蜗外毛细胞ICa-L的影响 VH为-60 mV、VT为0 mV时(图2)观察L-Arg对通道电流的影响。通道电流在L-Arg浓度为0.5×10-6mol/L ～1.5×10-6mol/L(低浓度)表现为浓度依赖性抑制，电流幅值和峰值电流密度随L-Arg浓度的增大而减小(图3～5)，洗脱后通道电流部分恢复。用药后5分钟内各组ICa-L峰值电流密度增幅最大值分别为：A组从3.78±1.40 pA/pF降至3.70±1.22 pA/pF，增幅为-2.12%，A组用药前后比较，ICa-L增幅差异无统计学意义(P=0.35，t=1.06)；B组从3.78±1.40 pA/pF降至2.62±0.85 pA/pF，增幅为-30.69%,用药前后比较，ICa-L增幅差异有极显著统计学意义(P=0.003，t=6.58)；C组从3.78±1.40 pA/pF降至1.32±0.17 pA/pF， 增幅为-65.08%, 用药前后相比，ICa-L增幅差异有极显著统计学意义(P=0.001，t=6.35)；A与B、B与C、A与C组之间比较，ICa-L的增幅差异均有极显著统计学意义(均为P<0.01)。

图2 VH为-60 mV，VT为0 mV时浴液内未加L-Arg时豚鼠耳蜗外毛细胞ICa-L

图3 VH为-60 mV，VT为0 mV时浴液内加入L-Arg 0.5×10-6mol/L时豚鼠耳蜗外毛细胞ICa-L

图4 VH为-60 mV，VT为0 mV时浴液内加入L-Arg 1.0×10-6mol/L时豚鼠耳蜗外毛细胞ICa-L

图5 VH为-60mV，VT为0mv时浴液内加入L-Arg1.5×10-6mol/L时豚鼠耳蜗外毛细胞ICa-L

图6 L-Arg对豚鼠单个耳蜗外毛细胞ICa-LI-V曲线的影响

2.3L-Arg对ICa-L作用的I-V关系 在低浓度状态下，L-Arg可使ICa-L减小，I-V曲线上抬(图6)，并且随指令电压的变化而发生规律性的变化，在锋电流电压下作用最明显，对反转电位无明显影响。

3 讨论

在耳蜗水平，钙通道主要是控制突触部位神经递质的释放，也可调节毛细胞中一些依赖Ca2+的细胞功能活动，包括适应慢收缩过程的调节。内毛细胞的钙通道与钾通道互相配合，参与感受器电位的调节。前庭感受器II型毛细胞的L型钙通道的特点与内毛细胞的相似，而对耳蜗外毛细胞和前庭感受器I型毛细胞钙通道研究资料较少。外毛细胞的L型钙通道在膜电位去极化至-30 mV时激活，与其静息膜电位-70 mV～-80 mV相距甚远，故生理意义尚不清楚。前庭感受器I型毛细胞L型钙通道的生物物理特性与前庭感受器II型毛细胞的差别不大，其功能可能是参与感受器电位的调节及突触部位递质的释放。

电压门控L型钙通道位于内毛细胞突触前膜，控制钙离子内流和内耳传入突触的递质释放[3]，对听觉产生有重要意义。耳蜗内的NO与耳蜗血流调节、内淋巴液离子稳定性和神经传递有关。生理条件下，NO维持内耳功能并与耳蜗蜗内电位(EP)、复合动作电位(CAP)、微音电位(CM)的产生有关[4]。基于L型钙通道和NO在耳蜗外毛细胞活动中的重要作用，本实验研究NO供体L-Arg对ICa-L的影响，结果可见在全细胞膜片钳记录方法下，L-Arg浓度为0.5×10-6mol/L ～1.5×10-6mol/L时，对L型钙通道电流表现为浓度依赖性抑制，电流幅值和峰值电流密度随L-Arg浓度的增大而减小，I-V曲线上抬，洗脱后通道电流部分恢复。

周建波等[5]指出，在生理条件下，体内的NO对耳蜗外毛细胞的保护作用可能是通过阻断外毛细胞L型钙通道电流的内流，从而抑制胞内Ca2+超载来发挥作用的，这也可能是病理生理过程初期阶段的一种保护机制。有文献报道应用低浓度L-Arg活体灌流耳蜗，可以部分拮抗H2O2对毛细胞的损伤[6]，也支持上述机制存在的可能性。本实验研究结果显示低浓度L-Arg抑制ICa-L的机制与上述文献报道一致。

通过本实验和既往实验研究结果[6]推测NO对L型钙通道的影响可以通过激活钙激活钾通道(KCa)的负反馈机制使K+外流，促使膜向超极化方向变化，使Ca2+通道关闭，降低胞内Ca2+水平。基于上述推测，NO生成过多或L型钙通道功能异常及病理条件下，耳蜗内氧自由基等代谢产物大量增加，可能造成外毛细胞胞内Ca2+增加，胞内钙超载，致细胞死亡，导致内耳疾病的产生和发展。临床上应用钙拮抗剂治疗内耳疾病有一定效果的实践，也从另一方面支持上述机制存在的可能性[7]。

综上所述，认为在调节豚鼠耳蜗外毛细胞的活动中存在NO/ICa-L途径。然而，NO在内耳的作用可能是多方面的，其作用机理十分复杂，简单的电生理研究仅能揭示NO在内耳作用的部分机制，并不能反映其全部的生理过程。今后有待于利用其它先进技术进一步研究，深入探索NO与ICa-L的详细作用机制。

(致谢：本研究实验部分在泸州医学院心肌电教研室完成，曾晓荣教授、李妙龄老师给予大力帮助，在此表示衷心的感谢！)

4 参考文献

1 Dulon D，Zajic G，Aran JM, et al.Aminoglycoside antibiotics impair calcium entry but not viability and motility in isolated cochlear outer hair cells [J].J Neurosci Res,1989,24：338.

2 Aran JM ,Erre JP,Lima da Costa D,et al.Acute and chronic effects of aminoglycosides on cochlear hair cells[J].Ann N Y Acad Sci,1999,884：60.

3 Catterall WA.Strueture and regulation of voltage-gated Ca2+channels[J].Annu Rev Cell Dev Bio1,2000,16:521.

4 李兴启，贾学斌，曹效平，等.一氧化氮-环磷酸鸟苷通路对耳蜗灵敏度的调节[J].中华耳鼻咽喉头颈外科科杂志，2006，41：532.

5 周建波，孔维佳.硝普纳对豚鼠耳蜗外毛细胞全细胞钙电流作用的实验研究[J].中华耳鼻咽喉科杂志，2003,38：259.

6 赖丹，黎万荣，李兴启.一氧化氮对过氧化氢所致听力损失的保护作用[J].生理学报，2004,56：237.

7 Mann W,Beck C,Beck C.Calcium antagonists in the treatment of sudden deafness[J].Arch Otorhinolaryngol,1986,243:170.