孙安科 胡平 李万同 孟庆延 陈伟 唐维维

目前以种子细胞和生物材料为基本要素、以再生和应用预定形态软骨组织为基本目标的软骨组织工程研究正深入展开。喉是全身软骨组织相对集中的部位，生理功能与美学意义依赖支架软骨的完整性，喉软骨腔状支架的特性决定了应用组织工程技术构建过程中继续探索合适生物材料及其塑形技术的重要性。与简单的再生片状软骨不同，作为喉支架形态软骨组织工程生物材料，除了应具有良好的生物相容性、适宜的降解性和合理的孔隙结构外，还应具有足够的机械强度和灵活的塑性要求。本研究在软骨组织工程研究的基础上[1，2]，尝试应用新型生物材料聚羟基丁酸酯与聚羟基己酸酯共聚物[poly(3-hydroxybutyrate-co -3-hydroxyhexanoate，PHBHH)]来探索组织工程生物材料喉支架形态塑形物的制备及其与软骨细胞的相容性，为组织工程喉软骨的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1主要仪器、试剂和材料 聚羟基丁酸酯与聚羟基己酸酯共聚物(PHBHH，分子量为60万，清华大学化学工程系提供)。DMEM/Ham-F12培养基(Gibco,美国)，Ⅱ型胶原酶(Sigma,美国)，多聚赖氨酸(Mr:18.9万；Sigma,美国)，胎牛血清(Fatal bovine serum,FBS,浙江四季青生物制品公司)，胰蛋白酶(Sigma,美国)，氯仿(上海化学试剂有限公司)，乙醇(上海化学试剂有限公司)，倒置相差显微镜(Olympus,日本)，扫描电镜(日本日立S550)，CO2培养箱(Queue,美国)。新西兰白兔乳兔和成兔(沈阳军区实验动物中心)。

1.2多孔PHBHH制备及其喉支架形态塑形

1.2.1塑形模具制备 以成年人全喉软骨形态为塑形参照，按3：1缩小制备出塑钢模型。以聚四氟乙烯为模具材料，雕刻出相应形态的阴模，模具由一个内芯和两块外板组成(图1)。

1.2.2多孔PHBHH制备与塑形 采用溶剂浇铸、模压成形和颗粒滤沥方法[3]制备具有喉支架形态生物材料塑形物。方法：定量PHBHH絮状材料置入球形耐热玻璃容器内，加入一定比例的氯仿溶剂，密封条件下加热回流，磁性搅拌器充分搅拌，待溶液成均匀的稀糊状后，迅速倒入盛有氯化钠盐粒(筛分为150～200 μm)的广口瓶内，密封瓶口，室温下过夜(使材料自然渗入盐层内)。取材料与盐的混合物先制备成片状，然后包裹模具芯部，再左右合拢外模，金属夹具固定，液体压缩成形。脱模样品置通风橱中至少48小时，使氯仿充分蒸发。然后放入真空抽滤器中抽滤12小时以除去可能残留的氯仿。将所得样品置一金属网内，悬于盛三蒸水的玻璃容器内，磁力搅拌，滤沥除盐，三蒸水至少更换三次。除去盐粒的样品自然干燥后做孔隙率测定。

1.2.3多孔PHBHH孔隙率测定 采用液体置换法[4]，因为PHBHH类生物材料具有亲油性，故以乙醇替代水，使得液体更易渗入材料的内部。测定方法：在一支可封闭的带刻度的试管中加入一定体积(V1)的乙醇，称取质量为M的待测试样加入试管内，密封，8小时后开盖一次(以释放气体)，再次封闭，24小时后乙醇足够渗入试样内的所有孔隙，记下此时的体积V2。饱和了乙醇的试样取出后，此时试管内乙醇的体积记为V3。则材料的密度ρ=M/(V2-V3)，孔隙率e =(V1-V3)/(V2-V3)×100%。

1.2.4材料消毒与表面助粘 喉支架形态材料塑形物应用前以75%酒精浸泡2小时，取出后无菌环境下晾半干，大量PBS漂洗至少3遍，干燥，无菌多聚赖氨酸溶液浸1小时，干燥后备用。

1.3PHBHH材料喉支架与软骨细胞复合

1.3.1软骨细胞获取 每批10只1周龄新西兰白兔乳兔，雌雄不限，无菌条件下取其肋软骨和关节软骨，去净软骨膜，0.1 mol/L灭菌磷酸缓冲液(0.1 mol/L PBS，含青、链霉素各200 U/ml)冲洗2遍，0.25%胰蛋白酶先消化2 min，PBS冲洗3遍；然后剪切成1～2 mm3左右碎块，PBS再浸洗一遍；置50 ml小烧杯中，加0.3%Ⅱ型胶原酶，37 ℃搅拌消化，自1小时起，每半小时收集细胞1次，直到全部固体物消失。所获细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用PBS洗2遍；DMEM/Ham-F12(1:1)混合培养液(含20% FBS)重悬细胞，台盼蓝染色，细胞计数板(细胞计数板)法计数(染色细胞判为失活力细胞，拒染细胞为活力细胞)。以2×105/ml浓度接种于100 ml培养瓶内，48小时换液1次，细胞贴满壁后传代。收集第3代培养软骨细胞，离心后制成细胞悬液备用。

1.3.2细胞与PHBHH材料喉支架复合 调整细胞悬液为5×107个/ml，采用多点播散方法将细胞悬液接种于经培养液预湿后约七成干燥的塑形材料上，12个PHBHH材料喉支架分3批接种，每批4个，接种时每次少量吸取细胞悬液，均匀点播，尽可能使细胞分布密度一致，塑形材料中空的内面以弯头吸管接种细胞。细胞与材料复合后置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱内孵育半小时取出，调整塑形材料的上下放置状态，将围绕材料底部的细胞悬液吸出再次自上而下接种，反复2次后，静止孵育1小时，再加入新鲜培养液，加入量以浸润复合物2 cm以上为宜。以后每48小时换液1次，倒置显微镜下观察复合物边缘细胞生长及附着情况。细胞与材料复合物体外共同培养1周，每批取1个用于本研究。

1.4PHBHH材料喉支架与软骨细胞复合物扫描电镜观察 PHBHH材料喉支架-细胞复合物在无菌蒸馏水中刷洗1次后迅速置2.5%戊二醛中固定，然后梯度酒精脱水、真空抽干，锋利刀片切开支架形态培养物，上、中、下部位取材，粘托，离子浅射喷金镀膜后扫描电镜观察。

2 结果

2.1多孔PHBHH喉支架形态塑形物外观 经模压成形的PHBHH材料喉支架软骨形态外观呈中空半面喇叭状，棱角分明，形态逼真，滤沥除盐后整体结构呈多孔海绵状(图2)。

2.2多孔PHBHH孔隙率 经溶剂浇铸、模压成形和颗粒滤沥处理获取的喉支架形态多孔PHBHH材料，饱和乙醇液体置换法测定其孔隙率为92%±2%，孔径100～150 μm，厚度1.5 mm左右。

2.3负载软骨细胞的PHBHH材料喉支架体外培养观察 接种细胞后24小时，倒置显微镜下边缘观察见细胞附于材料表面，第二次换液时肉眼下即可见材料表面有薄层透明胶冻状物均匀分布，培养1周胶冻样物质明显增多 (图3) 。

2.4扫描电镜观察

2.4.1单纯多孔PHBHH材料 呈多孔海绵状，彼此之间连性好，孔径约100～150 μm(图4)。

2.4.2PHBHH材料与细胞复合物 细胞密布材料表面及其海绵状空隙中，呈单个、串状或簇状分布，细胞周围黏液状的基质物质相互间有粘连，高倍镜下可见软骨细胞表面呈现多个类圆形小突起，可能为软骨细胞分泌的尚未融合的基质成分(图5)。

图1 以聚四氟乙烯为模具材料，雕刻的制备喉形态模具，由一个内芯和两块外板组成图2 制备出的喉支架形态PHBHH生物材料塑形物图3 负载软骨细胞的PHHHB材料喉支架体外共同培养一周倒置显微镜下观察(×100)图4 制备的多孔PHBHH泡沫材料扫描电镜观察(×500)图5 负载软骨细胞的PHHHB材料扫描电镜观察(×1 000)

3 讨论

组织工程技术为喉支架形态软骨修复重建提供了新思路和新方法，但在耳鼻咽喉科领域，软骨组织工程研究并未呈现出其应有的优势，究其原因可能在于喉软骨属中空不规则结构软骨框架，框架形态组织工程化软骨的构建与应用除了对种子细胞质量与数量有较高要求外，对其细胞外基质材料的生物相容性、降解性、孔隙结构、机械强度和塑形条件也有较高要求。 目前可作为软骨组织工程细胞外基质材料的生物材料主要包括以下四大类：天然生物材料(胶原、纤维蛋白和壳聚糖等)、人工合成生物材料[聚羟基乙酸(polyglycolic acid ，PGA)等]、由微生物合成的新型生物材料[聚羟基烷酸酯类生物材料及其共聚物(polyhydroxy alkanotes,PHAs)和复合材料(聚乳酸-胶原和纤维蛋白-聚氨酯)等][5]。这些生物材料在生物相容性、降解速率控制、内部结构设计、细胞黏附性、代谢微环境、机械强度及塑形灵活性等方面各有其优缺点，天然生物材料缺乏足够的机械强度，人工合成与复合生物材料普遍存在价格昂贵、加工工艺复杂、不易塑形等问题。虽然目前针对众多应用于软骨组织工程的生物材料尚缺乏系统的对照研究与统一标准，也还没有一种生物材料能完全符合软骨构建与应用的要求，但对于塑形要求较高的中空框架状软骨组织工程研究，新型生物材料PHAs显示出较好的性能[6]。

PHAs类材料是微生物在碳源过量，而氮源、磷源缺乏时，积累在体内作为营养和能量储存物质参与细胞代谢的天然物质，由微生物制造获取的PHAs，不含人工合成生物材料可能残留的有害物质，是极洁净的生物材料之一。PHAs具有高熔点、高结晶度、高分子量、耐拉伸和生物相容性良好、无致炎性、无排斥性和易降解等特点,而且与聚羟基乙酸(PGA)和聚羟基丙酸(PLA)相比，PHAs类材料酸性较弱，因此降解产物的酸性反应明显低于PGA和PLA[6，7]。研究表明，PHAs系列聚合物中，随着单体碳数的增加，力学性能存在着从脆性到粘性的转变。由于该系列聚合物种类较多，且聚合物之间有较好的相容性，通过对不同聚合物的优势组合，可以得到具有更佳强度、韧性、生物相容性和可控降解性的组织工程支架材料。由聚羟基丁酸酯[poly(3-hydroxybutyrate) ，PHB]与聚羟基已酸酯[poly(3-hydroxyhexanoate)，PHH]共聚而成的优化PHAs材料聚羟基丁酸已酸酯[poly(3-hydroxybutyrate-co -3-hydroxyhexanoate)，PHBHH]，不但具有PHAs类材料的优点，而且价格低廉、来源充裕、体内代谢及其生物反应性实验较充分，是值得关注与进一步研究的软骨组织工程生物材料之一[8]。

本研究以PHBHH絮状物为原料，采用溶剂浇铸、模压成形方法制备喇叭状喉支架形态PHBHH材料塑形物，滤沥除盐后支架塑形物形态保持良好，具有相当的机械强度。扫描电镜显示制备的塑形物材料呈多孔海绵状，孔径与筛分氯化钠盐粒大小基本相符。经乙醇体积浸润法测定海绵状材料孔隙率大于90%，符合组织工程生物材料多孔状、高孔隙率和具有一定机械强度的基本要求，为组织工程技术构建和应用像喉、气管这样中空状支架组织与器官提供了又一种选择材料。

为探讨多孔海绵状PHBHH材料能否作为理想的软骨组织工程种子细胞载体，本实验通过扫描电镜观察了体外培养的细胞-材料复合物中细胞与材料粘附、细胞分布、细胞生长及分泌基质状况等。结果发现多聚赖氨酸表面助粘的海绵状多孔PHBHH材料接种软骨细胞后细胞黏附率高、分布均匀，细胞-材料复合培养一定时间细胞周围及细胞与细胞间可见丰富的胶冻状物质，基质分泌旺盛，高倍镜下细胞表面呈现的多个颗粒状小体可能为细胞分泌的基质成分，说明细胞在材料表面生长状况良好。随着研究的深入，今后以人离体软骨作为种子细胞来源观察与PHBHH的相容性将更宜于临床应用。

本研究表明以溶剂浇铸、模压成形和滤沥除盐技术制备的喉支架形态组织工程PHBHH泡沫多孔生物材料具有良好的机械强度、孔隙率和细胞相容性，是中空支架形态组织工程化软骨组织构建与应用可选择的制备技术与生物材料之一。但其作为一种代替软骨的中空支架形材料，在受到内、外压力时，承受多大的压力而能保持其形态和内腔大小不变需要进一步进行实验验证。

迄今软骨组织工程研究已取得相当大进展[9,10]，但在喉支架形态软骨构建与应用方面尚未呈现出作为现代医学新技术的优势，面临着诸如血管化、黏膜化、柔韧化、复合化和支撑化腔状软骨及其附属组织共同构建与移植技术方法创立与完善的难题。以组织工程喉支架形态软骨研究为出发点，首先设想将组织工程软骨与组织瓣移植技术相结合应用于喉支架软骨病损的修复重建，有望使组织工程化喉支架形态软骨早日实现临床应用。在此基础上，继续不懈的探索支架形态组织工程软骨与黏膜、肌肉、韧带等复合化组织构建与应用的技术方法将是今后努力的目标。

4 参考文献

1 孙安科,陈文弦,崔鹏程,等. 同种异体工程软骨的构建和修复甲状软骨缺损的实验研究[J].中华耳鼻咽喉科杂志,2001,36:278.

2 孙安科, 裴国献, 周国平,等. 改良以聚羟基乙酸为支架同种异体组织工程化塑形软骨的构建[J].第一军医大学学报,2002,22:996.

3 Mikos AG,Sarakinos G,Leite SM,et al.Laminated three-dimensional biodegradable foams for ues in tissue engineering[J]. Biomaterials,1993,14:323.

4 Zhang R, Ma PX. Poly(alpha-hydroxylacids)hydroxyaptite porous composites for bone-tissue engineering: Preparation and morphology[J]. J Biomed Mater Res,1999, 44 :446.

5 詹兴旺,姜艳.软骨组织工程化用细胞支架生物材料的研究进展[J].中国矫形外科杂志, 2010,18:1 530.

6 Zhao K, Deng Y, Chen J,et al.Polyhydroxyalkanoate(PHA) scaffolds with good mechanicalproperties and biocompatibility[J]. Biomaterials, 2003,24:1 041.

7 Kose GT, Korkusuz F,Ozkul A,et al. Tissue engineered cartilage on collagen and PHBV matrices[J]. Biomaterials, 2005,26:5 187.

8 Deng Y, Lin X, Zheng Z, et al.Poly(hydroxybutyrate-co-β-hydrobexanoatey) promoted production of extracellular matrix of articular cartilage chondrocytes in vitro[J]. Biomaterials, 2003,24:4 273.

9 Tani G, Usui N, Kamiyama M, et al. In vitro construction of scaffold-free cylindrical cartilage using cell sheet-based tissue engineering[J]. Pediatr Surg Int,2010,26:179.

10 Kim DY, Pvun J, Choi JW, et al. Tissue-engineered allograft tracheal cartilage using fibrin/hyaluronan composite gel and its in vivo implantation[J]. Laryngoscope,2010,120:30.