陶学勇 陈乾美 耿勇 李皓琳 刘敏 翟性友

慢性氟中毒是无机氟在体内长期蓄积所引起的全身器官和组织的毒性损害[1]，氟中毒对骨骼、牙齿、神经系统等全身多器官的损害已被人们所公认。氟造成中枢神经系统损伤的研究中，也有学者发现氟中毒患者可出现不同程度的听觉功能损害[2]，但听觉损害的部位、机制尚不十分明确。随着分子生物学的发展，线粒体DNA突变与耳聋发病的关系越来越受到重视，许多耳聋者都伴有各种线粒体DNA突变[3]。本研究通过对慢性氟中毒大鼠行畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emissions，DPOAE)测试及内耳组织线粒体DNA(mtDNA)片段缺失突变的观察，拟进一步探讨氟中毒对听力影响的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选择体重60～100 g的健康SD大鼠60只(由贵阳医学院动物实验中心提供)，雌雄不分, 耳廓反射灵敏，随机分为正常对照组，低氟组和高氟组，每组20只。

1.2慢性氟中毒大鼠造模 正常对照组20只大鼠喂饲普通饲料(氟含量0.92 mg/kg)(贵阳医学院实验动物中心提供)。低氟组、高氟组大鼠分别喂饲含20%、75%的燃煤型氟病区烘烤玉米的混合饲料，氟含量分别为35.1、105.0 mg/kg，各组大鼠均饮用自来水，喂养6个月后体重350～480 g。期间观察大鼠生长发育状况及氟斑牙情况，监测体重、尿氟含量指标。氟斑牙分级[4]:0级(正常)：釉质黄色半透明；1级(极轻)：釉质浑浊或见隐约白纹；2级(轻度)：釉质明显浑浊，白色条带沿釉质横纹分布；3级(中度)：釉质失去光泽，见棕白色相间条纹；4级(重度)：牙体缺损。

1.3尿氟收集及测定 每月及处死动物前收集一次 12 小时尿, 采用氟离子电极法测定尿氟。

1.4DPOAE测试 各组动物均于饲养后6个月分别进行DPOAE测试，记录双耳DPOAE反应幅值[5]。

1.5实验动物取材及聚合酶链式反应(plymerase chain reaction，PCR)测试 动物行DPOAE测试后快速断头，打开颞骨，取出听泡,解剖显微镜下分离耳蜗，去除半规管、前庭神经和中耳结构。沿听神经中枢端分离蜗核组织。取颞肌组织约1克。上述组织分离后迅速置于-70 ℃冰箱备用。线粒体DNA提取参考文献[6]，使用引物对L4395 (5’-ACTTAACCAGACCCAAACACG-3’，4395-4418)和H5164 (5’- CCTCTTTTCTGATAGGCGGG-3’,5164-5145)扩增野生型mtDNA片段，长度770 bp。使用引物对L8022 (5’-ACCGACTACACTCATTTCAAC-3’，8022-8042)和H13117 (5’- AAGCCTGCTAGGATGCTTC -3’, 13117-13099)扩增缺失型mtDNA片段，长度262 bp。若模板内存在mtDNA4834缺失，电泳结果可见262 bp条带，说明mtDNA4834缺失阳性。PCR方法：总体系 25 μl，包括TaqDNA 聚合酶0.5 μl、引物1(15 μmol) 1 μl、l10×buffer 2.5 μl、引物2(15 μmol) 1 μl、4×dNTP 2 μl、模板 2 μl、25 mmol/L MgCl21.5 μl。PCR扩增条件为： 94 ℃ 预变性4 min，94 ℃变性30 s，退火56 ℃ 30 s，72 ℃延伸50 s， 72 ℃ 8 min,反应30个循环。各组PCR扩增反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙啶染色,凝胶成像仪成像并保存结果。缺失型PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,其产物送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序。

1.6统计学方法 用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，各组mtDNA4834缺失的发生率比较用χ2检验，各组之间DPOAE反应幅值比较采用t检验。

2 结果

2.1各组大鼠生长发育状况及氟斑牙情况 对照组大鼠生长状态良好。 实验组大鼠出现不同程度的精神萎靡、毛发干燥、活动减少, 摄氟量越高生长状态越差。大鼠饲养至 3 个月, 高氟组出现4级氟斑牙;大鼠饲养至6 个月, 低氟组出现3级氟斑牙。

2.2各组大鼠不同时间尿氟测定结果 随喂养时间推移, 氟中毒组大鼠尿氟呈上升趋势。在各检测时间段高氟组和低氟组大鼠尿氟均高于对照组,差异有统计学意义 (P<0.05)(表1)。

2.3DPOAE测试结果 各组DPOAE 测试结果见表2,低氟组、高氟组8 kHz反应幅值与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05) ,0.5、1、2、4 kHz各组反应幅值比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4mtDNA缺失片段扩增结果的检测 分别用引物对高氟组、低氟组和正常对照组的耳蜗、蜗核和颞肌组织提取的DNA进行PCR扩增，高氟组、低氟组大鼠耳蜗、蜗核组织可扩增到所预期的262 bp条带，证明存在mtDNA4834缺失，氟中毒组大鼠内耳组织可扩增到262条带缺失发生率明显高于颞肌组织；正常对照组大鼠耳蜗、蜗核和颞肌组织扩增到262 bp条带的缺失发生率很低(图1)。

表1 各组大鼠不同时间尿氟测定结果

表2 各组大鼠不同频率畸变耳声发射反应幅值比较

注:*与对照组比较，P<0.05

图1 高氟组、低氟组、正常对照组大鼠耳蜗、蜗核、颞肌组织以引物对扩增的mtDNA野生型和缺失型片段的PCR产物电泳结果

M为Marker，1～3 依次为高氟组大鼠颞肌、蜗核、耳蜗组织；4～6 依次为低氟组大鼠颞肌、蜗核、耳蜗组织；7～9 正常对照组组大鼠颞肌、蜗核、耳蜗组织。所有标本均可扩增出770 bp的线粒体DNA保守片段，存在4834缺失的标本可以扩增出262 bp的线粒体DNA缺失片段高氟组、低氟组、正常对照组大鼠mtDNA4834缺失的检测结果见表3，可见，高氟组大鼠耳蜗和蜗核组织均存在普遍的mtDNA4834缺失，颞肌组织中mtDNA4834缺失发生率较低，对照组大鼠耳蜗、蜗核组织中mtDNA4834缺失发生率明显低于高氟组及低氟组(P<0.01)，各组颞肌组织中mtDNA4834缺失发生率差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠耳蜗、蜗核、颞肌mtDNA4834缺失发生率(%)

注：*与对照组比较，P<0.01

3 讨论

Kemp等[6]认为,采用DPOAE测试耳蜗功能快速灵活, 所测的频率更宽。本实验发现对照组与低氟组、高氟组8 kHz DPOAE反应幅值差异均有显著统计学意义(P<0.05),说明慢性氟中毒能导致大鼠高频听功能的损害，并且随着氟中毒的加重, 听力损害亦加重。有文献报道[7]，应用扫描电镜观察发现慢性氟中毒可致内、外毛细胞的纤毛发生粘连、倒伏、融合、缺失等病理改变，并以耳蜗底回明显,从形态学上证实了氟中毒对听功能影响的可能机制。有研究表明[8]，ABR阈值升高的大鼠耳蜗和蜗核中存在mtDNA缺失，可能与听觉敏感性下降有关。本实验发现，慢性氟中毒导致的感音神经性听力损失大鼠(包括高氟组和低氟组)的耳蜗、蜗核组织可发生mtDNA4834缺失，其缺失发生率明显高于正常对照组(P<0.01)；而慢性氟中毒组中与听觉无关的颞肌组织mtDNA4834缺失发生率很低，与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，提示mtDNA4834缺失与慢性氟中毒引起的感音神经性听力损失有关。氟中毒导致mtDNA损害的机制尚不是十分清楚，考虑为多方面机制相互协同作用的结果，可能为：①通过氧自由基损害作用，自由基代谢紊乱是氟中毒发病中的一个重要环节[9]；自由基可以改变正常细胞周期，导致细胞周期折返，诱发受累细胞凋亡[10]；②氟影响线粒体膜内外Ca2+的平衡及细胞的功能：慢性氟中毒时可存在细胞膜钙通道迅速开放，钙内流增多，使细胞内游离钙水平明显增高[11]。mtDNA片段缺失到一定程度后可使呼吸链合成蛋白发生障碍，ATP产生减少，而ATP对毛细血管和血管纹等维持内耳离子平衡和内环境稳定非常重要[12]。目前氟中毒造成mtDNA缺失的确切机制还不十分明确，有待于分子水平上的进一步探讨。

4 参考文献

1 李健学，曹守仁. 地方性氟中毒防治研究进展[J].中国地方病学杂志，1994，13：182.

2 谭郁彬. 氟对机体代谢及各系统的影响[J].中国地方病防治杂志，1994，9：230.

3 Prezant TR,Agapian JV,Bohlman MC,et al. Mitochondrialribosomal RNA mutation associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafness[J].Nat Genet,1993,4:289.

4 侯铁舟，郭海燕，陶洪，等.小鼠氟牙症分级标准的建立[J].国际口腔医学杂志，2009，36：140.

5 僧东杰，陈乾美，刘鲜林,等.大鼠慢性氟中毒听觉损伤的实验观察[J].中华耳科杂志，2008，6:162.

6 Ausabel Frederick M,Kingston Robert E,Seldman J,等，著.金由辛，译.精编分子生物学实验指南[M].北京：科学出版社，1998.30～31.

7 Kemp DT. Otoacoustic emissions, their origin in cochlear function,and use[J]. Br Med Bull, 2002, 63: 223.

8 Sediman MD， Bai C，Khan MJ, et al.Mitochondrial DNA associated with aging and presbyacusis[J].Arch Otolaryngol Neck Surg，1997，123：1 039.

9 边建朝，王海明，刘传蛟.自由基损伤及细胞凋亡与氟中毒发病研究进展[J].地方病通报，2003,18:100.

10 Thompson LV.Oxidative stress,mitochondria and mtDNA-mutator micc[J].Exp Gcrontol,2006,41:1 220.

11 Zerwekh JE， Morris AC,Padalino PK,et al.Fluoride rapidly and transiently raises intracellular calcium in human osteoblasts[J]. Bone Miner Res,1990,5(suppl 1):131.

12 Seidman MD,Anman N,Joshi D,et al.Agerelated hearing loss and its association with reactive oxygen species and mitochondrial DNA damage[J].Acta Otolaryngol,2004,552(Suppl):16.