杨蒙生 贾宏博 谷京城 刘振华 穆兰

耳石是内耳前庭椭圆囊和球囊中一种碳酸钙生物矿物质合成物，在空间定向和平衡保持等方面具有重要的作用。然而，外伤、老龄化、耳毒性药物、内耳缺血、微量元素缺乏等诸多因素均可引起耳石在内耳的分布、代谢等发生变化，临床上常见的老年平衡障碍、良性阵发性位置性眩晕、外伤后眩晕等也与其密切相关[1，2]。

尽管耳石和位觉砂有奇特的外形及重要的生理功能，但目前对其形成及再生却了解甚少。前庭耳石的再生虽然涉及较多的环节，但最主要的首先是有机基质和相关无机盐离子的相互作用问题。有机基质虽然含量较少，但却与耳石的发生、代谢和某些病变等关系重大[3]。研究发现在斑马鱼和青鳉胚胎期耳内均有较强的富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(SPARC)表达[4，5]，其结构上有与钙离子高亲和力结合的区域，而钙离子是耳石再生过程中一个非常重要的无机盐离子。成熟动物前庭终末器官SPARC的分布如何，其在成熟耳石破坏后再生过程中的作用是否与胚胎耳石发生相似，具体的变化和作用如何，这些尚不十分清楚。

本研究利用机械力破坏耳石的动物模型[6，7]，观察SPARC在豚鼠成熟耳石破坏后再生过程中的分布和变化情况，以期为进一步揭示SPARC在成熟耳石破坏后再生中的作用提供一定实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选用健康白色红目豚鼠40只，体重300～400 g，雌雄不限，Preyer’s反射灵敏，鼓膜完整，随机分为对照组(10只，不给予任何刺激)和离心力高过载刺激组(高G组，30只，给予5 min 10 G的离心力刺激)，高G组又分为高G刺激后当天、三天和七天组，每组各10只，分别于刺激后即刻(0.5～1小时)、第3天和第7天，对阳性症状者断头处死，剥离听泡并制作冰冻切片。

1.2离心力高过载刺激方法及观察指标 高G组刺激方式[6，7]：利用臂长为2 m的动物离心机，以400 deg/s的速度匀速旋转产生10 G的力场环境；动物右耳向旋转轴心，身体长轴沿旋转轨迹的切线方向与地面平行；头部通过特制的木盒固定，使其在刺激过程中不会发生各方向的位移和体位改变，离心力上升速度为1 G/s,达到10 G后开始计时，4 min后以同样的加速度值减速，这样动物可受到4 min的+10 G离心力刺激。

刺激完后观察豚鼠前庭躯体反射，包括有无头位偏斜、头位震颤、身体侧斜倾倒、侧滚、原地转圈、行走步态不稳等，以及受刺激后活动增强或减弱，神态变化，反应是否灵敏等，记录其持续时间。凡是上述观察指标中出现其中任何一项或一项以上症状者记为阳性，为造模成功的标准。

1.3电镜观察 取造模成功(耳石损伤)后动物，快速断头处死，取出听泡，2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液蜗内冲洗灌注固定，按常规扫描电镜标本制备方法准备，日立SEM-800型扫描显微镜下观察，拍照。

1.4免疫组化SP法染色观察耳石再生不同阶段前庭SPARC的表达 取造模成功的动物于各组相应时间点进行组织取材固定，严格按试剂盒说明书操作。以细胞质和(或)细胞核内出现黄色或黄褐色颗粒为SPARC阳性细胞。免疫组化切片经显微镜观察和照相机照相后，采用HMIAS21000型高清晰度彩色医学图文分析系统测定各组切片染色的平均灰度值。根据各组切片染色阳性细胞率和阳性细胞显色强度进行免疫组化评分(ISH)[8]：A为阳性细胞数分级，分为5级：0～1%=0、 1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4，B为阳性细胞显色强度分级，分为4级：0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性)，IHS=A×B。

1.5统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，组间比较采用方差分析，高G组不同时间两两比较使用Post-Hoc方法。

2 结果

2.1前庭行为学表现 高G组豚鼠刺激后有23只动物出现阳性症状即造模成功，阳性率76.67%(23/30)，当天组8只、三天组7只、七天组8只，每组动物各种症状持续时间普遍较短，均在30 min内消失。所有症状中，以头位震颤的发生率最高，其他症状出现时几乎都伴有头位震颤。每组各取5只用于检测SPARC在内耳的表达观察，其余用于电镜观察。

2.2电镜下耳石器变化 对照组未见异常，囊斑表面均匀分布不同大小的耳石，耳石呈现为棱柱体结构，两端为三棱椎体形，表面光滑，长径在2～28 μm之间；毛细胞纤毛排列整齐，无明显粘连及倒伏(图1a)。高G组刺激后1 h(当天组)囊斑表面出现大量球状物，在高倍镜下，可见球状物主要呈现“线团状”，由大量的纤维缠绕组成球状结构(图1b)；刺激后3 d(3天组)除上述原始初期的球状物外还可以见球状物逐步发生矿化，即缠绕的纤维逐步由类似矿物质的东西代替和填充(图1c)；刺激后7 d(7天组)，原始初期的球状物逐渐减少，矿化的球状物逐渐增加，此外可见球状物与耳石共存的现象：在球状物之间，夹杂新生的小耳石，这些耳石部分呈哑铃状，部分在形状上已与正常成熟耳石无显著差别(图1d)。此外，各组均可见到耳石“变性”现象，主要表现为耳石表面粗糙、出现裂纹以及大量耳石聚集粘合、结成团块状结构。

2.3前庭SPARC的表达情况 结果显示，SPARC蛋白在内耳均呈现出“多点”表达的特点，即其并非只在耳石的原位——椭圆囊和球囊囊斑的感觉上皮有表达，在感觉上皮临近和相对位置的非感觉上皮以及壶腹、半规管和耳蜗等多个部位均有丰富表达，在椭圆囊和球囊囊腔、半规管内等也有染色阳性物质出现。对照组前庭囊斑上皮组织细胞中SPARC有微弱表达，显色不清或阳性细胞呈浅褐色(图2a)；当天组前庭囊斑的支持细胞、移行细胞、基底细胞中表达量明显增强，阳性细胞增多，阳性细胞染色强(图2b)；三天组和七天组的豚鼠前庭囊斑的所有细胞内均可见SPARC有较强的表达(图2c、d)。各组SPARC免疫组化染色的平均灰度值及IHS评分见表2，与对照组相比，当天组、三天组和七天组中SPARC的表达均增加(即平均灰度值减低)，差异有统计学意义(P<0.05)；高G组三组间SPARC的表达逐渐增强，但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，其他三组的IHS评分升高(P<0.05),高G组三组间的评分比较均逐渐升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组豚鼠囊斑中SPARC的表达

注：与对照组比较，*P<0.05

图1 各组豚鼠囊斑耳石(×2000) a～d依次为对照组、高G刺激后当天组、三天组、七天组

图2 各组豚鼠囊斑SPARC的表达(SP×200) a～d依次为对照组、高G刺激后当天组、三天组、七天组

3 讨论

本研究采用离心力高过载破坏豚鼠成熟耳石[6，7]，发现豚鼠出现各种行为症状持续的时间普遍很短，均在30 min之内恢复正常，此结果与Ott等对金鱼耳石破坏后观察的结果相似[9]，根据他们的观点，前庭器官结构上的恢复时间不会这么短，这种代偿可能主要是一种功能性的而非结构性的。

前庭耳石器系统由感受线加速度和重力加速度的球囊和椭圆囊组成，囊斑表面有一层耳石膜，由耳石层、胶质层和顶下网状结构组成，耳石是耳石膜的主要组成部分，所以如果其所处的力场发生改变(如超重)，会引起其结构重量等的变化，此已为许多研究所证实[10]。本实验电镜观察结果显示，离心力过载作用会造成耳石的原形态消失和耳石的再生——球状物的出现，随后球状物逐步向成熟期转化。分析本实验条件下(离心力高过载作用)引起上述变化的可能原因是：耳石的比重大约是内淋巴的3倍，其与下方的胶质层借结缔组织紧密相连，10 G环境下，其与胶质层的剪切力增加，但其与胶质层的结合力并未改变，因此极易发生脱离移位，因此认为高G环境使耳石与胶质层的剪切力成倍增加，从而引起耳石移位和代谢障碍是以上各种结构改变的主要原因，此与头部外伤时机械性外力打击造成的耳石移位具有某些相似性[11]。此外，不排除其他诸如机械性作用以及高G作用引起的局部血液循环障碍等因素的作用。

SPARC是一种具有多种功能的小分子酸性糖蛋白，曾被人们称作骨连接蛋白、基底膜-40、43K蛋白，是一种分泌性钙结合糖蛋白，属于matricellular蛋白家族[12]，在机体内分布广泛，能在多种组织细胞尤其是在那些正在发育和重建的组织中表达。其多肽C端有一既可以与细胞外钙离子结合也可以与胶原结合的区域，可能对钙离子的分泌和聚集起到辅助作用，并且在其内部有一类似卵泡抑素的区域，可能影响其周围细胞的增殖、分化和粘附[13]。多肽N端有一与钙离子高亲和力结合的酸性区域，可能在成骨和矿化方面起到连接胶原和矿物质的作用。2007年在前庭耳石器中发现了SPARC-like 1, countertrypin, and fetuin-A等蛋白，未能确定其作用[14，15]也说明其可能与前庭耳石器之间存在一定的关系。

目前对SPARC在前庭的研究多集中于胚胎期动物的研究，Rotllant等[16]最近用斑马鱼研究发现SPARC是咽部软骨及内耳形成后期阶段所必须的有机物；Kang等[17]敲除SPARC基因后，动物耳石在大小、形状、数量上出现不同程度的改变以及表现为行为和姿态的障碍。以上均说明SPARC可能在耳石发生中起很重要的作用，但对其在成熟耳石中如何表达以及在成熟耳石破坏后的表达部位和强度变化如何等研究却较少。本研究结果显示高G组SPARC的表达部位与对照组相比并无显著变化，但强度上有差异，离心力高过载刺激后各组在耳石再生过程中，支持细胞、毛细胞中SPARC的表达量显著增加，并且在一周内，随着离心力高过载刺激后时间的延长，SPARC在前庭囊斑中的表达相应增强。结合形态学的改变说明耳石从球形向菱形体和柱状体逐渐转化的过程中，SPARC的表达呈逐渐增加的趋势。从SPARC蛋白的分布特点以及其表达趋势来看，推测其对增加球状物内部的Ca2+浓度以及启动耳石核心的CaCO3结晶化方面有很重的作用，提示SPARC与球状物逐步成熟、发生矿化形成成熟耳石的过程有关，即耳石的矿化过程需要大量SPARC等有机物的参与来引起CaCO3结晶化合融合。但SPARC在耳石再生过程中的具体作用目前尚不清楚，有待进一步深入研究。

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