王允亮，张 昱△，王洪霞，郝 伟

(1.中国中医科学院西苑医院肾病科，北京 100091;2.中国中医科学院西苑医院基础药理实验室，北京 100091)

蛋白尿是慢性肾脏病(CKD)的常见临床表现之一，也是肾脏病进行性发展的重要因素之一[1]。蛋白尿的持续增多往往导致肾小球硬化，最终出现肾功能衰竭[2]。应用有效方法控制和治疗蛋白尿是临床关注研究的热点。加味黄芪赤风汤是导师张昱主任医师创制的治疗慢性肾脏病蛋白尿的有效验方，本实验采用阿霉素肾病大鼠模型，进一步研究加味黄芪赤风汤对蛋白尿的确切疗效，并从抗自由基损伤的角度探讨其作用机理，为本方提供现代科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物

同龄、健康、雄性SD大鼠，体重180g±20g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国中医科学院西苑医院SPF级动物房。标准食水适应性喂养3d。

1.2 药品与试剂

加味黄芪赤风汤(生黄芪、赤芍、防风、芡实、地龙、白花蛇舌草等)生药饮片由中国中医科学院西苑医院提供;洛汀新由北京诺华制药有限公司生产(批号X1374);注射用盐酸多柔比星(速溶性)Pfizer Italia s.r.l.生产(进口药品注册号 H 20080278，进口药品注册标准Jx20000016);超氧化物歧化酶、丙二醛试剂盒购自南京建成科技有限公司。

1.3 方法与分组

实验第1天将SD大鼠随机分为空白组(8只，简称K组)与阿霉素肾病组(36只)。空白组尾静脉一次性注射等量的生理盐水，并每日灌服等体积生理盐水;阿霉素肾病组采用尾静脉一次性注射阿霉素6mg/kg的方法造模，再将阿霉素肾病大鼠随机分为(1)模型组(9只，简称M组):每日灌服等体积生理盐水;(2)2倍加味黄芪赤风汤组(9只，简称A组):每日按生药20.8g/kg以水煎剂灌服;(3)正常剂量加味黄芪赤风汤组(9只，简称B组):每日按生药10.4g/kg以水煎剂灌服;(4)洛汀新组(9只，简称L组):每日按2mg/kg灌服洛汀新混悬液。各组灌服均从造模后第2周末开始，持续至实验第8周末结束。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 一般状态 每日上午9时观察各组大鼠的大体情况(饮水量、体毛色泽、尾部清洁度、胸腹四肢、睾丸及排便情况)。

1.4.2 24h 尿蛋白定量 实验第 2、4、6、8 周末将大鼠置于清洁代谢笼中，留取24h尿液，用全自动生化分析仪(日立7600-020)以焦酚红/钼酸盐法测定24h尿蛋白含量。

1.4.3 血生化指标 实验第8周末留尿结束后，4%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，经离心后用全自动生化分析仪(日立7600-020)测定血清白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)和总胆固醇(TCH)。

1.4.4 肾脏皮质超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA) 实验第8周末腹主动脉取血后留取左侧肾脏，做肾脏皮质组织匀浆，按试剂盒说明书以硝酸还原酶法进行数值测定。

2 结果

2.1 一般状态

一次性注射阿霉素后，M组、B组、L组分别有1只在实验第7～10天中死亡。K组大鼠活动自如，毛色光泽，精神状态良好，未见四肢肿胀、腹水及睾丸水肿;M组大鼠均有不同程度的体毛缺乏光泽，少动，四肢及睾丸可见水肿，尾部色泽深浅不一，大便偏稀;各给药组四肢及睾丸水肿程度较M组轻，尾部色泽深浅不一，少数体毛色泽乏亮。

2.2 对24 h尿蛋白含量的影响

表1显示，M组大鼠24h尿蛋白量从第2周开始明显升高，与同期K组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)，并且随着时间的推移大鼠24h尿蛋白定量逐渐增加，至第6周时出现大量蛋白尿;与同期M组相比，A组大鼠24h尿蛋白定量在第4～8周明显下降(P＜0.05);与同期 M组相比，B组大鼠24h尿蛋白定量在第4周末明显下降(P＜0.05)，随后几周未见统计学差异(P＞0.05);与同期 M组相比，L组大鼠24h尿蛋白定量在第4，6周末无统计学差异(P＞0.05)，在第 8周末明显下降(P＜0.05)。各期各灌药组间无统计学差异(P＞0.05)。

表1 各组24h尿蛋白比较

表1 各组24h尿蛋白比较

注:与空白组(K)比较:▲▲P＜0.01;与模型组(M)比较:*P＜0.05

group n 2周 4周 6周 8周K 87.13 ± 1.73 9.25 ± 2.89 10.26 ± 1.42 9.74 ± 1.65 M 8 36.43 ±19.41▲▲ 66.92 ±28.99▲▲ 97.74 ±39.18▲▲ 83.89 ±33.53▲▲A 9 32.87 ±19.68▲▲ 36.16 ±19.69▲▲＊ 63.86 ±22.42▲▲＊ 50.11 ±27.72▲▲＊B 8 31.87 ±16.86▲▲ 39.98 ±18.19▲▲＊ 75.98 ±28.67▲▲ 51.40 ±31.79▲▲L 8 36.27 ±13.88▲▲ 44.16 ±21.97▲▲ 64.50 ±29.15▲▲ 41.93 ±22.16▲▲＊

2.3 对血清白蛋白、总蛋白和总胆固醇的影响

表2显示，与K组相比，M组大鼠血清ALB显著降低(P ＜0.01)，血清 TCH 显著升高(P ＜0.01);A组大鼠血清 ALB、血清 TP升高(P＜0.05)，与 M 组相比差异均具有统计学意义;B组大鼠血清ALB升高(P＜0.05)，与 M组相比差异具有统计学意义;各灌药组间无统计学差异(P＞0.05)。

表2 各组血清白蛋白、总蛋白、总胆固醇比较

表2 各组血清白蛋白、总蛋白、总胆固醇比较

注:与空白组(K)比较:▲P ＜0.05，▲▲P ＜ 0.01;与模型组(M)比较:*P ＜ 0.05

group n ALB(g/L) TP(g/L) TCH(mmol/L)K 8 34.30 ± 1.31 57.14 ±2.99 1.43 ±0.20 M 8 26.45 ±3.05▲▲ 53.95 ±4.78 5.07 ±1.74▲▲A 9 30.47 ±3.77▲＊ 60.03 ±6.15* 5.00 ±1.28▲▲B 8 30.41 ±3.04▲▲＊58.03 ±5.97 4.53 ±1.87▲▲L 8 29.20 ±2.12▲▲ 55.63 ±5.25 4.58 ±3.25▲

2.4 对肾脏皮质超氧化物歧化酶和丙二醛的影响

表3显示，与 K组相比，M组大鼠肾脏皮质SOD降低(P＜0.05)，肾脏皮质 MDA显著升高(P＜0.01);与M组相比，A组大鼠肾脏皮质SOD显著升高(P＜0.01)，肾脏皮质 MDA 降低(P＜0.05);与M组相比，B组大鼠肾脏皮质SOD显著升高(P＜0.01)。

表3 各组肾脏皮质超氧化物歧化酶、丙二醛比较

表3 各组肾脏皮质超氧化物歧化酶、丙二醛比较

注:与空白组(K)比较:▲P ＜0.05，▲▲P ＜ 0.01;与模型组(M)比较:*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01

group n SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)K 8 45.65 ± 2.38 0.28 ± 0.05 M 8 37.07 ± 8.70▲ 0.56 ±0.23▲▲A 9 62.08 ±10.16▲▲＊＊ 0.34 ±0.12*B 8 71.04 ±29.79▲＊＊ 0.43 ±0.21 L 8 42.80 ± 5.75 0.51 ± 0.09▲▲

3 讨论

阿霉素肾病模型是目前广泛应用于肾病研究的动物模型，本文依照 Bertani[3]方法复制阿霉素肾病模型。根据24h尿蛋白定量，所有肾病模型大鼠2周时均出现蛋白尿，模型组大鼠蛋白尿随着时间的推移持续升高，致造模后6周时出现尿蛋白高峰，之后稍有下降，但24h尿蛋白排泄量仍维持在较高的水平。

阿霉素属于蒽环类药物，通过代谢可生成过氧化氢、羟、氧自由基，造成局部自由基堆积，从而损伤肾脏。多数观点认为，其自由基损伤是造成肾脏足细胞损伤、足突融合、滤过屏障破坏的机制之一[4]。SOD是机体内广泛存在的一种重要酶，其含量高低反应清除自由基能力大小。MDA为脂质过氧化的降解产物，其含量高低则代表脂质过氧化的程度。本实验结果表明，加味黄芪赤风汤能够显著降低阿霉素肾病大鼠蛋白尿，提高肾组织SOD水平，降低肾组织MDA水平，改善肾脏自由基损伤。

洛丁新是临床上西药用于治疗蛋白尿的常用药物之一。AIPRI[5]研究提示，其具有良好的降低蛋白尿、抑制肾功能恶化的作用。其治疗肾脏病的主要机制包括:一是有效降低系统高血压，同时扩张出球小动脉＞扩张入球小动脉，降低球内高压;二是阻断AngⅡ，降低肾小球滤过膜孔径屏障的扩大，减少蛋白尿的滤过;三是可抑制细胞增生、肥大，减少肾小球细胞外基质蓄积，延缓肾纤维化进展。因此，选择该药作为阳性对照药来观察对蛋白尿的疗效。本实验结果提示，洛丁新在第8周时对蛋白尿的降低作用与模型组比较具有统计学意义，而洛丁新组肾组织SOD、MDA的变化与模型组比较无统计学意义，这与其作用机制有关。应该指出的是，作为西药治疗蛋白尿的常用药物，血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI类)和血管紧张素受体拮抗剂(ARB类)已广泛应用于临床，并得到了肯定的疗效，选择ACEI类药物洛丁新作为本实验的阳性对照药是可行的;正是由于中西药物的不同作用机制，才导致了在疾病治疗上的不同效果。

黄芪赤风汤出自清·王清任《医林改错》，由黄芪、赤芍、防风组成，用于治疗气血痹阻所致瘫腿诸疾，“能使周身之气通而不滞，血活而不瘀”[6]。临床应用加味黄芪赤风汤治疗慢性肾脏病蛋白尿疗效显著[7]。方中重用生黄芪益气补虚。现代药理研究表明，黄芪富含微量元素硒以及黄酮、皂苷、多糖等有效成分，是参与清除自由基、抗氧化的重要物质[8-9];防风轻用，剔除肾络风邪，具有免疫增强、抗氧化、抗凝等功效。与黄芪配伍，更能增强黄芪的功效;赤芍、地龙活血化瘀，增加肾血流量，具有增强免疫力，改善高凝状态，清除自由基，抑制和排除免疫复合物的作用;芡实健脾升清，补肾涩精，调节血脂，减少蛋白尿;白花蛇舌草清热利湿解毒，具有免疫增强作用，能刺激单核-巨噬细胞系统增生和增强吞噬细胞活力，从而达到抗感染作用，还有一定的抗氧化作用。诸药配伍，既能健脾补肾，又可祛风利水、活血解毒，共奏标本兼治、虚实同调之功。

[1]Lea J，Greene T，Hebert L，et al.The relationship between magnitude of proteinuria reduction and risk of end-stage renal disease:Results of the African American Study of Kidney Disease and hypertension[J].Arch Intern Med.2005，165:947-953.

[2]刘 红.蛋白尿与慢性肾脏病变的进展[J].肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6(4):357-362.

[3]Bertani T，Poggi A，Pozzoni R，et al.Adriamycin-induced nephritic syndrome in rats:sequence of pathologic events[J].Lab Invest，1982，46(1):16-23.

[4]匡裕玖，周建华.氧自由基在大鼠阿霉素肾病发生中的作用探讨[J].中华医学研究杂志，2004，4(2):103-105.

[5]The GISEN Group.Randomised placebo-controlled trial of effect of ramipril on decline in glomerular filtration rate and risk of terminal renal failure in proteinuric，non diabetic nephropathy[J].Lancet，1997，349:1857-1863.

[6]王清任.医林改错[M].北京:人民军医出版社，2007.73.

[7]张 昱.加味黄芪赤风汤治疗慢性肾炎蛋白尿50例临床观察[J].中医中药，2007，4(36):137.

[8]严 彬，牛 茜，南晓东，等.黄芪注射液对大鼠肾缺血-再灌注损伤的影响[J].医药导报，2006，25(1):10-12.

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