李艳彩，李元军，黄富英，王 飞，王水金

(漳州师范学院 化学与环境科学系，福建 漳州 363000)

肌红蛋白位于肌肉的肌细胞中，其功能是可逆地结合氧气，将氧气贮存于肌肉细胞中.从结构上来看，Mb以血红素作为活性中心，与一些以血红素为辅基的酶 (如辣根过氧物酶、 细胞色素等 )的结构相似，含有一个供底物结合的空缺配位点.因此Mb常作为研究酶的结构与功能关系的模型化合物.Mb表现出的生理功能及参与的代谢过程，大多数涉及电子传递过程.因此用电化学方法研究Mb的氧化还原反应及类酶性质，具有得天独厚的优势.同时，Mb由于相对便宜易得，是研究血红素蛋白质和酶的电子传递反应的理想模型物.但由于Mb与固体电极之间的直接电子转移速率较缓慢，不得不借助于媒介体或促进剂[1-2]进行研究.Rusling等[3-4]报道，在涂布于热解石墨(PG)电极上的表面活性剂薄膜中，Mb与电极之间的电子传递可大大加速，这为研究蛋白质在模拟生物膜中的直接电化学提出了一个新思路.

碳纳米管(CNTs)的中空管状结构、大长径比、高机械韧性及良好的导电性为其在电化学和电分析化学中的广泛应用奠定了基石[5-7].研究表明，CNTs产品的不同预处理方法极大地影响其电化学性质[8].此外，因为CNTs通常是一种相互缠绕的，找不到终端的线团状结构，管壁间因存在强的范德华力而极易发生团聚且不溶于任何溶剂，这些都既不利于其在电极表面的修饰也不利于修饰后其优点的发挥，所以人们往往采取各种办法使之尽量能够分散均匀.蔡称心等[9]在1%(w)的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液中得到了理想的 CNTs 分散液.CTAB属于季铵盐型阳离子表面活性剂.具有水溶性好，耐酸、耐碱和抗菌功效的特点，广泛应用于食品、化妆品、个人护理用品、消毒剂等方面.CTAB的化学结构如下所示，非极性区域含有正电荷[10].

以一种肌红蛋白作为研究对象，通过CTAB利用CNTs直接把Mb固定到玻碳电极(GCE)表面.CTAB的存在能够提供出一种快速有效地分散溶解单壁碳纳米管的方法，并且更容易的将肌红蛋白固定到SWCNTs表面.先前CTAB的生物相容性的表征将提供一种更好的微环境来保持蛋白的活性[11].本文希望通过SWCNTs-CTAB复合膜来更好地提高电极表面蛋白的直接电子转移能力.文中已经通过不同的电化学方法对复合膜中的肌红蛋白进行了表征，得到了一系列参数.同时得到复合膜电极对NO2-的表现出良好的电催化活性，该制备方法简便、廉价、可避免蛋白的失活.电极具有很好的稳定性和重现性.

1 实验部分

1.1 试剂

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自国药集团化学试剂有限公司；肌红蛋白(Mb)购于Sigma生物化学试剂有限公司；单壁碳纳米管(Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs，纯度超过95%)购自深圳纳米港；亚硝酸钠(30wt.%)购于天津市福晨化学试剂厂.0.1 mol/L不同pH值的磷酸盐(PBS)缓冲溶液是通过混合Na2HPO4和NaH2PO4的标准溶液，并加入KCl作支持电解质配制而得；其他所有化学试剂均为分析纯试剂并未进行进一步处理；所有的溶液均用二次蒸馏水配制.

1.2 仪器设备及测试方法

KQ-50B型超声波仪器清洗器；电化学实验在CHI650C电化学工作站(CH Instrument，USA)上进行.电化学池采用三电极系统：玻碳电极(3 mm直径)为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl(3.0 mol/L KCl)电极为参比电极.实验温度为室温(20±2)℃.循环伏安实验在静止的体系中进行.所有溶液在电化学实验前通氮气20 min，并在实验过程中保持氮气保护氛围，以消除溶液中溶解氧的影响.

1.3 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的制备

1.3.1 CTAB-Mb-SWCNTs试剂的制备 取50 mg CTAB溶解于5.00 mL蒸馏水中，超声搅拌15 min，使其完全溶解，再取5 mg的SWCNTs作为分散剂，超声15 min使其完全溶解，呈黑色均匀的液体.再称取25 mg Mb超声30 min使其完全溶解，得到CTAB-Mb-SWCNTs试剂，呈黑色均匀的液体.

1.3.2 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的修饰与测定 玻碳电极(3 mm直径)依次用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3粉末打磨抛光，并在乙醇和蒸馏水中交替超声清洗3次，用铁氰化钾检测液检验电极可逆性，氮气吹干待用.用微量注射器取18 μL滴到处理干净的电极表面，置于冰箱中24 h.取pH 7.0磷酸缓冲溶液PBS，先冲氮气20 min，实验过程中保持氮气保护氛围，以消除溶液中溶解氧的影响.

2 结果与讨论

2.1 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的直接电化学

图1给出了不同电极在pH 7.0磷酸缓冲溶液中的循环伏安对比图.在所给电势范围内观察图1a和c可知，在裸玻碳电极和CTAB-SWCNTs/GCE都没有出现氧化还原峰.而CTAB-Mb/GCE修饰电极(图1b)和CTAB-SWCNTs/Mb/GCE(图1d)都有一对氧化还原峰.CTAB-SWCNTs/Mb/GCE循环伏安曲线上有一对峰形良好的且可逆的氧化还原峰，其峰电流比CTAB-Mb/GCE修饰电极的大得多.阴极峰和阳极峰电位分别为-0.192 V和-0.278 V，式电位Eθ′[Eθ′=(Ep,c+Ep,a)/2]为-0.235 V，该氧化还原峰应归于Mb的电活性中心血红素的氧化还原[Mb-Fe(III)/Mb-Fe(II)].CTAB-SWCNTs/Mb/GCE在缓冲溶液中进行循环伏安扫过数圈后得到稳态电流，所有关于膜电极的循环伏安测试都是在稳态电流下进行的.该膜电极之所以能很好地实现Mb的直接电子转移主要是因为SWCNTs的纳米尺寸效应、电子结构表面的拓扑缺陷.另外，SWCNTs的特性能增加了玻碳电极的有效面积.因此，很容易在CTAB和SWCNTs修饰的玻碳电极上得到肌红蛋白的直接电子传递信号.

图2是CTAB-SWCNTs/Mb/GCE不同扫速时在pH 7.0的磷酸缓冲溶液中测得的循环伏安图.由图3可知在10到500 mV/s扫速范围内，随着扫速的不断增大氧化峰电流和还原峰电流呈线性增大，但峰电位几乎不随扫速的增加而改变.氧化峰和还原峰与扫速之间的线性回归方程分别为：Ipc(μA)=5.179+0.175 v(mV/s)(R=0.9981)； Ipa(μA)=-1.769-0.165 v(mV/s)(R=0.9988).这些结果表明该电极反应是一个表面控制的单层电化学过程[12]，同时也说明了膜中所有的电活性[Mb-Fe(III)]在阴极扫描中全部被还原成[Mb-Fe(II)]，然后在反向阳极扫描中又全部转化为[Mb-Fe(III)].结果充分表明SWCNTs-CTAB复合膜为实现电极上肌红蛋白的直接电子转移提供了一种合适的微环境.

2.2 不同电极在铁氰化钾溶液中的循环伏安图

由图4a可知，裸玻碳电极的循环伏安曲线峰峰电位差是0.079 V，说明裸玻碳电极具有良好的导电性.而CTAB-SWCNTs/Mb/GCE在铁氰化钾溶液中的循环伏安曲线的氧化峰电流和还原峰电流减少(见图4b)，说明Mb在CTAB和SWCNTs的共同作用下，形成一层复合膜阻碍了铁氰化钾中Fe(III)的电子转移.

图3 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的阴极峰电流、阳极峰电流与扫速的关系曲线 图4 裸玻碳电极(a)和CTAB-SWCNTs/Mb/GCE(b)在5 mmol/L铁氰化钾溶液中的循环伏安曲线，扫速为200 mV/sFig 3 Relationship between scan rate and the anodic and cathodic peak current of CTAB-SWCNTs/Mb/GCEFig.4 Cyclic voltammograms of bare GCE (a) and CTAB-SWCNTs/Mb/GCE (b) in 5mmol/L Potassium ferricyanide solution at a scan rate of 200 mV/s

2.3 pH值对电极电位的影响

研究了支持电解质溶液的pH值对CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的影响.图5给出了缓冲溶液pH在5.0到9.0范围内CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的典型循环伏安曲线.随着缓冲溶液pH的增大，膜电极的氧化峰和还原峰都负向移动，且循环伏安曲线峰形良好而稳定.图6A给出了式电位与pH的关系曲线，在pH4.0到9.0的范围内，[Mb Fe(III)]/[Mb Fe(II)]电对的式电位随着pH值的变化而呈线性关系，斜率为-33.3 mV/pH.此斜率值比18.C下一个质子参与的单电子转移反应的理论值57.6 mV/pH要小的多.原因可能是反式配体的质子化作用对血红素周围的铁和氨基酸的影响，也可能是水分子与中心铁之间的质子化作用所致.所以，Mb与电极之间的电子转移反应可以简单的用下式表达：

Mb-Fe(III)+H++e-↔Mb-Fe(II)

图6B是 pH值和还原峰电流I的关系曲线，还原峰电流随pH的增大而增大，且在pH=7.0的时候，峰电流达到最大值.可知该体系反应的最适宜pH为7.0.所以该实验都是在pH 7.0的缓冲溶液中进行的.

图7 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE在NaNO2浓度分别为0 mM(a)、0.3 mM(b)、0.7 mM(c)、1.3 mM(d)和3.1 mM(e)溶液中的循环伏安曲线，扫速为200 mV/sFig.7 Cyclic voltammograms of CTAB-SWCNTs/Mb/GCE in 0.1 M solutions containing 0 mM (a), 0.3 mM (b), 0.7 mM (c), 1.3 mM (d) and 3.1 mM (e) NaNO2

图5 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE在不同pH值( 5.0､6.0､7.0､8.0､9.0)的0.1mol/L 磷酸缓冲溶液中的循环伏安图,扫速为200 mV/s 图6 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE中[Mb-Fe(Ⅲ)]/[Mb-Fe(Ⅱ)]电对的(A)式电位与溶液pH 值的关系曲线,(B)还原峰电流与溶液pH 值的关系曲线

Fig 5 Cyclic voltammograms of CTAB-SWCNTs /Mb /GCE in buffer solutions at different pH (5.0~9.0) values at a scan rate of 200 mV/s Fig．6 Relationship between Formal potential (A)and the anodic peak current(B)and pH of solution

2.4 NaNO2在CTAB-SWCNTs/Mb/GCE上的电催化还原

如图7a，在pH 7.0的磷酸缓冲溶液中，CTAB-SWCNTs/Mb/GCE循环伏安图仅仅显示一对氧化还原峰，加入NaNO2后，该循环伏安曲线发生了明显的变化，在-0.9V处的还原峰急剧增大.随着NaNO2的增加，还原峰电流呈递增的趋势.而在-0.2 V处得氧化峰逐渐减小，还原峰逐渐增大.说明固定化的Mb对NaNO2的还原有明显的电催化作用.这对亚硝酸钠的检测具有十分重要的意义.

2.5 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的稳定性和重现性

通过检测修饰电极储存在冰箱中以后电流的大小变化来研究修饰电极的稳定性.在-4℃下保存7 d后，电极没有表现出明显的电流减小；而保存三周以后仍然保持原有的电流响应的92%.制备5根相同的电极，通过检测电极对10 mM NaNO2的电流响应来观察电极的重现性.得到的相对标准偏差(R.S.D)为3.6%.传感器的良好的稳定性意味着十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与单壁碳纳米管(SWCNTs)具有良好的生物相容性并且适于固载肌红蛋白.因此CTAB-SWCNTs能更好的吸附Mb实现电子传递，同时保持生物活性.

3 结论

本实验通过CTAB-Mb-SWCNTs/GCE复合膜将血红蛋白固载到玻碳电极表面，实现了Mb与电极之间的直接电子转移，为氧化还原蛋白质的直接电化学研究提供了一种新的思路.该修饰电极对NaNO2的还原具有很好的催化响应，可以作为检测NaNO2的生物传感器.该复合膜电极制备方法简便易行，价格低廉，稳定性好.

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