田国政,孙东发,汪兴平

(1.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000;2.华中农业大学 植物科学技术学院，湖北 武汉 430070)

根霉在酿酒工业中用来作淀粉质原料酿酒的糖化菌，我国是最早利用根霉糖化淀粉生产酒精、分解大豆蛋白制酱的国家，在激素、酶制剂等方面的应用也在不断深入[1].ERh1123、ERh3421、ERh5131 3个根霉菌株是从恩施酒曲中分离出来的优势根霉菌株[3]，在适宜的温度、pH值、水分、营养等条件下便开始繁殖生长[2]，在繁殖生长的过程中能产生大量的糖化酶、液化酶、蛋白酶等，根霉生长的好坏、产酶量及酶的活性均受到生长环境的限制，本文主要从pH条件方面研究根霉的生长及其对产酶活性的影响.

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料：ERh1123 、ERh3421、ERh5131 3个根霉菌株保存在湖北民族学院微生物实验室， 3～5℃冰箱保藏.

仪器设备：UV-2550型分光光度计，日本岛津公司；CR-21G型离心机，日本Hitachi公司；万分之一电子天平，上海天平仪器厂；高压蒸汽锅，上海；超净工作台，上海物理光学仪器厂；新飞冰箱，河南新飞电器有限公司；恒温震荡器，金坛市富华仪器有限公司；酸度计，美国Thermo720A+.

试剂：Na2SeO3、NaCO3、 Na2HPO4、H2O2、HNO3NaOH、Ni(NO30)2、酪氨酸、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、三氯乙酸、柠檬酸、酪素、磷钼酸、磷钨酸、硫酸锂、溴水、葡萄糖、淀粉、3,5-二硝基水杨酸(试剂均为AR).

1.2 方法

1.2.1 PDA培养基 马铃薯200 g，水1 000 mL，煮沸30 min，纱布过滤，再加20 g蔗糖和20 g琼脂，熔化后补足蒸馏水至1 000 mL.

1.2.2 不同pH值的培养基 按参考文献[4]进行，pH值范围是3.4、4.0、4.6、5.2、5.8、6.4、7.0,121℃灭菌40 min后迅速摇散.

1.2.3 孢子悬液的制备 将其接种于PDA培养基上，25℃培养3 d，加入20 mL无菌水,制备接种用的孢子悬液.

1.2.4 不同pH值培养基发酵的处理 取孢子悬液0.5 mL接种于不同pH值培养基中，摇匀，30℃培养4 d得鲜曲，测定糖化酶、液化酶、蛋白酶活性，重复3次.

1.2.5 酶活力测定

1.2.5.1 液化酶、糖化酶活力测定与葡萄糖标准曲线的制作 按参考文献[5，6]的方法进行.得回归方程A=0.717 75C+0.010 24，r=0.997 0.

1.2.5.2 酪氨酸标准曲线制作与蛋白酶活力测定 按参考文献[7]的方法进行，得回归方程A=0.001 920 5C-0.005 185 9， r=0.999 6.

2 结果与分析

2.1 pH值培养基对3个根霉菌株产糖化酶活性的影响

根霉在生长的过程中受环境条件pH值的影响较大，主要表现为根霉的产酶能力和产酶活力方面.如图1所示，随着pH值的升高，糖化酶活力渐渐升高，在pH3.4时，菌株ERh1123产糖化酶的活力最低，pH 4.6时，糖化酶活力最大，为1.41×102U/g，在pH 5.2～7.0之间变化很小.而ERh3421、ERh5131菌株产糖化酶适宜的pH值为5.2.

2.2 pH值培养基对3个根霉菌株产液化酶活性的影响

由图2可知，ERh1123菌株产液化酶的能力随着pH值升高而上升，pH 4.6时，液化酶活性达到最高，为2.2×103U/g，之后酶的活性开始慢慢下降.ERh3421产液化酶的活性没有明显的变化，ERh5131产液化酶的活性随pH值上升而缓慢上升.

图1 不同pH值对3个菌株糖化酶的影响 图2 不同pH值对3个菌株液化酶的影响Fig.1 The effects of different pH on the saccharification enzyme activities Fig.2 The effects of different pH on the liquefied enzyme activities

2.3 pH值培养基对3个根霉菌株产蛋白酶活性的影响

由图3可知，在一定pH值范围内，对根霉产蛋白酶活性的影响较小.ERh3421、ERh5131菌株产蛋白酶的活性在pH值3.4～5.2时缓缓下降， pH 5.8时产蛋白酶的活性又上升到2.38×102U/g，以后又开始下降.ERh1123菌株在pH 3.4～7.0产蛋白酶的活性影响几乎没有变化.

2.4 反应pH值条件对糖化酶活性的影响

在适宜的pH条件下培养根霉菌株得到的酶液在不同的pH值条件下与底物反应，一定时间后测定糖化酶活性.由图4可知，不同的pH值处理对酶活力的影响较大，pH3.4～4.6时，ERh5131菌株产糖化酶活性呈上升阶段，pH 5.2时开始逐渐变小.pH3.4～4.0时，ERh1123、ERh3421产糖化酶活力没有变化， pH 4.6时两菌株产糖化酶的活性分别为3.2×102U/g、2.95×102U/g，pH 5.2以后随着pH的升高，酶活性下降，下降的幅度较大.与图1的结果比较，适宜的pH条件处理能明显的提高酶的活性.

图3 不同pH值对3个菌株蛋白酶的影响 图4 反应液pH值对3个菌株糖化酶的影响Fig.3 The effects of different pH on the protease activities Fig.4 The effects of the different reaction pH on the saccharification enzyme activities

2.5 反应pH值条件对液化酶活性的影响

从图5可知，反应pH值条件影响着液化酶活性，ERh1123菌株产液化酶液在pH 3.4～5.8之间液化酶液化淀粉的活性逐渐上升，pH 5.8时活性达到最大，为1.53×103U/g，pH 6.4时剧烈下降几乎为零，表明该酶的活性对pH值条件非常敏感.ERh5131菌株所产酶液在pH 3.4～5.2之间，液化酶活性随pH值的升高而上升，pH 5.2时，液化酶活性达到最大，为1.72×103U/g，pH 6.4时迅速下降.在pH 3.4～5.2时，ERh3421菌株产液化酶活性逐渐上升，pH 5.2达到最大，为1.24×103U/g，pH值5.8开始下降.

2.6 反应pH值条件对蛋白酶活性的影响

从图6可知，在一定pH值范围内，对蛋白酶的活性有一定的影响.pH 3.4～5.2时，蛋白酶活性变化较小， pH 5.8时蛋白酶的活性变大，其中ERh3421菌株产蛋白酶的活性相对较大，其次是ERh1123，ERh5131，蛋白酶的活性依次为2.97×102U/g，2.84×102U/g、2.56×102U/g，pH 6.4以后又开始下降.

图5 不同反应液pH值对3个菌株液化酶的影响 图6 不同反应液pH值对3个菌株蛋白酶活性的影响Fig.5 The effects of different reaction pH on the liquefied enzyme activities Fig.6 The effects of different pH on the protease activities

3 结论

采用pH值培养基和反应pH值条件对3个根霉菌株产酶活性的研究中发现，pH值对3个根霉菌株的生长及产酶活性的影响较大，在pH 4.6～5.8时，3个根霉菌株产酶活性相对较大，除此之外，酶的活性小很多.实验的过程中主要对糖化酶、液化酶、蛋白酶的活性进行了研究，发现酶的种类不同，适宜的pH范围不同，根霉菌株产糖化酶液化酶适宜pH为4.6～5.2，糖化酶的活性达到1.41×102～1.59×102U/g，液化酶的活性达到0.69×103～2.21×103U/g，菌株产蛋白酶的适宜pH 5.8，蛋白酶活性为1.98×102U/g～2.58×102U/g.酶在反应的过程中提供适宜的pH，有利酶促反应的进行，pH4.6时，糖化酶的活性可提高到1.52×102～3.21×102U/g，蛋白酶在反应的过程中提供pH5.8，酶的活性可提高到2.56×102～2.97×102U/g，液化酶在反应的过程中受pH值的影响较大，提供pH5.2～5.8，酶的活性明显高于其他的pH值范围，与产酶条件下提供的pH相比，不能提高液化酶的活性，但控制pH值是保证稳定酶活性的重要手段.在3个菌株中，ERh3421的优势更明显，其糖化酶、液化酶、蛋白酶的活性高于其他2个菌株.

[1] 周恒刚.试论根霉菌在制曲上的特征[J].酿酒，2001(6)：23-26，39.

[2] 李金生.糖化曲优良根霉分离技术[J].中国调味品，2002(4)：6-8.

[3] 周光来，田国政.酒曲根霉的纯化筛选初报[J].湖北民族学院学报:自然科学版,2000，18(4)：19-20.

[4] 薛应龙.植物生理实验[M].北京：高等教育出版社，1985：157.

[5] 张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术[M].北京：高等教育出版社，2003，1-3.

[6] 李宪臻，张宇，金凤燮.两株曲霉糖化性质的比较研究[J].食品与发酵工业，1994(6)：42-46.

[7] 中山大学生物系生化微生物教研室.生化技术导论[M].北京：人民教育出版社，1978：53-54.