李飞燕,梁荣蓉,张一敏,罗欣

近年来,冷却牛肉由于其安全卫生、营养丰富,逐渐成为肉类消费的主流。但新鲜牛肉因其高蛋白,高水分活度,在加工、贮藏、运输和销售等一系列过程中,极易遭受微生物的污染,引起肉品变质。引起牛肉变质主要是物理因素、化学因素、肉品内源酶的作用和微生物生长繁殖而引起的破坏作用,其中致腐性微生物的作用是主要因素[1]。微生物的数量在冷却肉品质变化中扮演重要的角色[2-3]。冷却肉保存在0～4℃的低温环境中,嗜温性微生物的生长受到了一定的抑制。然而,如果冷链系统不够完善,微生物会迅速增殖,加速变质,甚至会对公共健康构成潜在的威胁[4]。微生物引起的牛肉腐败可以导致新鲜度降低,牛肉品质的各种理化指标也随之发生变化。李苗云等[5]通过对贮藏过程中冷却猪肉品质指标的关系研究,发现从尸胺的数量可以推知微生物的数量来判断冷却猪肉的腐败程度。石飞云等[6]认为,感官鉴定能快速反映肉的品质状态,菌落总数跟感官检测基本一致,但挥发性盐基氮的检测有滞后性。国外对肉品变质过程菌落总数的变化也有详细的报道,用微生物、生化指标结合感官鉴定来评价贮藏期间产品的新鲜度和质量[7-8],但对冷却牛肉变质过程中腐败指标的相关性分析的研究很少。本实验通过研究冷却牛肉贮藏过程中微生物的变化趋势、理化指标的变化规律及他们的相关性分析,为客观评价牛肉的微生物品质提供依据,为延长冷却牛肉货架期提供有效手段。

1 材料与方法

1.1 材料

从山东某肉牛屠宰基地取 9条常规屠宰后牛背最长肌 (宰后 24 h的西冷),并随机分成 3组,每组 3条。无菌操作将牛背最长肌修去筋腱后,垂直于肌纤维方向切成 25 cm2大小,厚约 1～2 cm的肉块。将每一个肉块分别置于低密度的聚乙烯保鲜袋中,在4℃恒温箱中分别贮藏 0、2、4、6、8、10、12、14 d。

1.2 仪器与设备

GB204分析天平 (瑞士,Mettler Toledo);LDZX立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗器械厂);DHG-9240A电热鼓风干燥箱 (上海一恒科学仪器有限公司);BagMixer400均质器 (法国,Interscience);SPX-400智能型生化培养箱 (宁波江南仪器厂);DK-S28电热恒温水浴锅 (上海精宏实验设备有限公司);MP120pH计 (瑞士,Mettler Toledo);UDK-126D半自动凯氏定氮仪 (意大利WELP公司);centrifuge5415D离心机 (德国,Eppendorf);SP62色差计 (美国,爱色丽 X-Rite)等。

1.3 方法

1.3.1 细菌总数的测定

每隔相应时间无菌操作取 25 g牛肉,用灭菌剪刀剪碎置于均质拍打袋 (BagFilter(r)400 inter-science,France)中,加入 225 mL灭菌蛋白胨生理盐水,用均质器 (Bag Mixer(r)interscience,France)拍打60s,然后按照 1∶10稀释 ,按照 GB4789.2-2008《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》用稀释平板法测定细菌总数。

1.3.2 嗜冷菌总数的测定

测定方法同细菌总数,培养条件为 4℃下培养7d[9]。

1.3.3 pH值的测定

用便携式 pH计按照 GB 9695.5-2008《肉与肉品 pH测定》中的方法测肉浸出液的 pH值。

1.3.4 挥发性盐基氮 (TVB-N,total volatile basic nitrogen)的测定

每隔相应时间取相应肉样 10.00 g绞碎搅匀,分别置于锥形瓶中,加入 100 mL水,不时振摇,浸渍 30 min后过滤,滤液置冰箱备用。按 GB/T5009.44-2003半微量凯氏定氮法测定挥发性盐基氮含量。国家标准规定一级鲜肉≤15 mg/100 g,二级鲜肉≤20 mg/100 g,变质肉 ≥20 mg/100 g。

1.3.5 失水率的测定

低速离心法[10]:离心速度为 3 000 r/min,离心时间为 3 min,试样 3 g,试样形状为:1.5 cm ×1.5 cm ×0.5 cm。

1.3.6 色差值的测定

每隔相应时间取相应肉样用 x-rite SP62便携式色度仪测定L值、a值、b值(L为白度值,a为红-绿值,b为黄-蓝值)。每个样品至少测定 3个位点,取L、a、b的平均值,并计算DE的值。DE=(a2+b2)1/2,类似于色彩的饱和度或者亮度。

1.4 数据处理

本实验微生物指标的测定是每个样品至少 2个平行,取平均值;理化指标的测定是每个样品至少 3个重复,取平均值。各指标数据采用 EXCEL2033进行统计分析和作图,SAS 9.0统计软件进行相关性分析和作表。

2 结果与分析

2.1 冷却牛肉贮藏过程中微生物指标的变化

从图1可以看出,随着贮藏时间的延长,菌落总数和嗜冷菌总数呈不断增长的趋势。由于环境的改变,微生物需要适应新的环境即迟滞期,而使得前 5 d微生物数量变化不大,从第 6天开始进入对数期,第12天时有明显的增长。对照肉品质量卫生指标中菌落总数的建议标准:新鲜肉为 104CFU/g以下,次鲜肉为 104～106CFU/g,变质肉为 106CFU/g以上[11],可知第 12天时嗜冷菌数已经远大于 106CFU/g,且嗜冷菌增长速度较菌落总数快,这主要是因为生产和流通过程中,虽然冷却肉在低温控制下 (0～4℃),但在加工过程中会受到一些嗜冷菌污染,如嗜冷杆菌属和假单胞菌属等,由于这些嗜冷菌具有耐冷特性,在冷藏条件下仍然会大量生长和繁殖,最终导致冷却肉发生腐败变质,造成很大损失[12-13]。国外很多文献对冷藏温度下的肉的微生物污染情况都有详细的描述[14-15],单从微生物数量多少来判定肉品的新鲜度是不客观的,这主要与肉品在屠宰、加工、贮藏、运输和销售过程中遭受微生物污染的程度、微生物种类及其在肉品表面及其内部是否大量生长繁殖等有关。

图1 4℃下冷却牛肉菌落总数与嗜冷菌总数的变化

2.2 冷却牛肉贮藏过程中 pH值的变化

根据相关标准,肉类在低 pH值的情况下能较好的保持新鲜感[16]。新鲜肉浸液的 pH值一般在 5.6～6.0内。由图2可见,本实验所取冷却牛肉经过 2h排酸后初始 pH值为 5.80,随着贮藏时间的延长 pH值先降低后上升。pH值先下降是由于肌肉中糖原酵解产生乳酸,三磷酸腺苷也分解出磷酸,乳酸和磷酸逐渐积累,从而使肉的 pH值下降,低 pH值抑制了微生物的活动,此 pH值能维持到牛肉的成熟,大约 7～10 d左右,随着牛肉成熟期的延长,肉中的蛋白质在细菌、酶作用下被分解为氨和胺类化合物等碱性物质而使 pH值升高,从图中也可知从第 12天牛肉的 pH值迅速升高。有研究认为相比较于细菌数量,pH值等理化指标被认为是肉和肉制品微生物腐败的化学指标[17-18]。而 pH值下降的速度和程度对贮藏过程中肉的颜色、系水力以及细菌的繁殖等均有影响。

2.3 冷却牛肉贮藏过程中 TVB-N值和失水率的变化

图2 4℃下冷却牛肉 pH值的变化

挥发性盐基氮 (TVB-N)是由于在牛肉的腐败过程中酶和细菌对其作用,使蛋白质分解产生氮以及胺类等有挥发性的碱性含氮物质。从图3可知,冷却牛肉所含挥发性盐基氮的量,随腐败变质的进行而增加,在第 12天时迅速升高且超过 20 mg/100 g,可知实验所用的牛肉在第 12天时已经腐败。但在第 14天时 TVB-N值有所降低,这可能与样品差异性及微生物活动减弱有关,具体原因还需进一步的研究。结合图2、图3可以看出,由于某些细菌可以水解蛋白质,从而导致 TVB-N与 pH都有增长趋势,这与 Rodriguez等的研究结果相一致[19]。从图3中失水率的变化趋势图可以看出牛肉的系水力最初变化不大,从第 10天开始系水力有所提高,这主要是因为在冷藏过程中,导致腐败的微生物的生长繁殖需要利用牛肉中的水分,从而使得牛肉的系水力有所上升。

图3 4℃下冷却牛肉 TVB-N值和失水率的变化

2.4 冷却牛肉贮藏过程中色差值的变化

色泽是影响消费者购买力的重要影响因素,而颜色的改变是产品腐败的指示性标志[20]。色差值中的a值和 DE值的变化能较好的反应牛肉的色泽稳定性[21]。图4中的 a值和 DE值先升高是由于开始时牛肉处于有氧状态下肌红蛋白和氧气发生反应暂时生成不稳定的鲜红色氧合肌红蛋白[22],然后随着氧气的消耗,同时生成 CO2等其他产物,形成低氧分压环境,氧合肌红蛋白变成高铁肌红蛋白,导致牛肉的色泽逐渐变暗从而使a值和 DE值降低。从图4中可看出a值和DE值的标准差较大,这主要是由于不同肉样间具有差异性,但总体趋势都是降低的。

图4 4℃下冷却牛肉色差值的变化

有的学者对肉作了感官评定,但是感观评定带有主观因素,而且只能检测到后期的腐败[23-24]。本实验通过检测冷却牛肉的理化指标和微生物指标,结合变化趋势图可以知道随着贮藏时间的延长,微生物数量、挥发性盐基氮都是增长的趋势,系水性、a值、DE值呈下降趋势,但在转折点有显著的变化,根据图4的变化趋势和拐点可确定该实验中的冷却牛肉在第12天时已腐败。

2.5 微生物指标与理化指标的相关性分析

冷却牛肉在 4℃下微生物指标和理化指标随着贮藏时间的延长而不断的变化,从表1通过 pearson相关系数可以确定各腐败指标之间的关系。Byun研究了在贮藏期间不同的物理、化学指标与肉的货架期的关系,发现 TVB-N等指标与肉的微生物指标有关[25-26]。Eager man等比较发现a值与肉的感官特性相关性大[27]。表1各指标中菌落总数与 pH值、失水率显著相关,与a值、TVBN值极显著相关并且相关系数都在 0.80以上,故菌落总数是冷却牛肉品质的重要影响因素。在冷却牛肉的贮藏过程中,由于原料肉的来源不同,屠宰、加工环境和运输过程等不同可能造成所污染的微生物有很大的不同[22,28],同时微生物之间的交互作用非常复杂,而冷却牛肉污染的初始菌数的多少对货架期的影响很大,McMeekin等研究发现食品在保藏时的腐败部分决定因素是最初污染的菌落数[29]。因此本研究对牛肉污染的微生物与影响腐败品质的各指标之间的相关性研究很有重要意义。

从表1还可看出嗜冷菌与失水率、a值显著负相关,与 TVB-N极显著相关,这主要是由于冷却牛肉在4℃的冷藏温度下,引起腐败的主要是嗜冷性微生物。但菌落总数与各指标的相关性比嗜冷菌大,且在实际的流通中冷却牛肉不能一直在冷藏温度下,嗜冷菌有一定的局限性,因此菌落总数更能反映冷却牛肉的内在品质。这一结果与徐亚丹等对基于质地及动力学特性的牛肉新鲜度检测中的结果相一致。pH值、TVBN值是肉品质的重要指标[30],这一结论与本研究结果不矛盾,但从表中可以确定色差a值与菌落总数在 0.01水平上相关,与 DE值、TVBN值、嗜冷菌等也有较高的相关性,所以a值可以作为冷却牛肉品质变化的一个指标。

表1 冷却牛肉在 4℃下各品质指标的 Pearson相关系数

3 结论

冷却牛肉在 4℃贮藏过程中随着微生物数量的增长,各理化指标也是呈现不断的动态变化,其中菌落总数与 pH值、失水率在 0.05水平上显著相关,与a值、TVBN值在 0.01水平上极显著相关,且大于嗜冷菌与各个指标的相关性,其中菌落总数与 TVBN的相关性最大,在第 12天时 TVBN值超过 20 mg/100 g,而a值与菌落总数的相关性较大且在 12 d也有显著的降低,可确定第 12天时冷却牛肉已腐败。因此可根据 TVBN值、a值来确定冷却肉的微生物品质状况,从而为肉牛加工企业的环境和质量安全提供保证。

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