朱文赫,郭志刚,刘红建,郭祥瑞,孙德军

(1.吉林大学再生医学科学研究所 生物技术药物教研室,吉林 长春 130021;2.吉林大学 中日联谊医院 骨科,吉林 长春 130033)

具有自激活切割活性肠激酶轻链基因设计、表达及活性研究

朱文赫1,郭志刚2,刘红建1,郭祥瑞1,孙德军1

(1.吉林大学再生医学科学研究所 生物技术药物教研室,吉林 长春 130021;2.吉林大学 中日联谊医院 骨科,吉林 长春 130033)

目的 获得 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列 +牛 EKL的 cDNA序列,实现 EKL基因在大肠杆菌中的融合表达和自切割。方法 用 Trizol法从牛十二指肠组织中提取总 RNA,利用 RT-PCR技术扩增其 cDNA片段,将此片段克隆于表达载体 p GEX-2T,并在其前引入肠激酶 (EK)识别序列。结果 所表达蛋白经 SDS-PAGE分析,相对分子质量约为 61 000,经 GST-Sepharose亲和色谱柱纯化后得到单一蛋白,SDS-PAGE显示单一条带,用微量 EK引发自切割,切断 GST标签蛋白和 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列,采用对氨基苯甲脒-Sepharose亲和色谱获得了轻链 EK的单体。结论 成功地克隆、表达了牛 EK轻链基因,采用自激活、切割获得了 EK单体,每 1 L培养基获得 EK 5 mg,为进一步进行重组牛 EK活性的研究及应用奠定了基础。

肠激酶;大肠杆菌表达系统;谷胱甘肽转移酶;自激活

肠激酶 (Enterokinase,EK)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶,EK相对分子质量 (Mr)为 150 000,由 1条 Mr115 000重链和 1条Mr35 000轻链组成。重组融合蛋白经 EK酶解所释放的目的蛋白质 N末端氨基酸序列具有和野生型相同的一级结构[1],EK由于专一识别 5个氨基酸多肽 (D-D-D-D-K-X1)并在赖氨酸的羧基上切割,是 N末端融合通常选择的蛋白酶,在其他残基的不规则切割发生水平较低,这取决于蛋白质底物的构象。……