张业辉，黄利华，温其标，唐传核，*

（1.广东省农业科学院农业生物技术研究所，510610；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640；3.广州城市职业学院建筑环境与食品工程学院，广东广州510405）

芸豆蛋白淀粉样纤维聚集后属性的变化研究

张业辉1，2，黄利华3，温其标2，唐传核2，*

（1.广东省农业科学院农业生物技术研究所，510610；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640；3.广州城市职业学院建筑环境与食品工程学院，广东广州510405）

研究探讨了芸豆蛋白的淀粉样纤维聚集后的溶液和形成凝胶属性的变化。一定浓度的蛋白质溶液在低pH和低离子强度的条件下，加热可以形成线性聚集。蛋白质分子热聚集，导致了溶液和形成的凝胶性质上发生了较大的改变。淀粉样纤维蛋白质的形成可以通过刚果红的波长扫描来确定，流变仪测定蛋白溶液的粘度和形成凝胶的强度，扫描电镜观察蛋白质构象变化后的微观形态。

芸豆蛋白，加热聚集，淀粉样纤维，性质变化

芸豆（Phaseolus vulgaris）又名腰豆，是一种营养丰富且广泛种植的食用性豆类作物，据测定芸豆中蛋白质含量23g/100g左右。芸豆蛋白与大豆蛋白相比具有更加优良的功能性质，如相同条件下的芸豆蛋白比大豆蛋白具有更好的乳化性和凝胶性［1-2］。在研究开发食品新特性和功能的时候，通常可以通过改变原料的结构和性质达到目的。目前，富含蛋白的食品显现出受消费者青睐的趋势，这类产品的种类和数量也日益增多，而芸豆可作为粮豆配合开发新营养主食品种的原料［3］。蛋白质的热凝胶也越来越多地被应用于食品加工中。影响蛋白质形成淀粉样纤维的因素主要有加热的温度、溶液的pH、离子强度等。蛋白质淀粉样纤维是较高程度的各向异性的蛋白聚集，在一定条件下蛋白聚集的长度大约有几个微米，直径因蛋白的差异而有所不同。蛋白质淀粉样纤维可在低pH和高于变性温度条件下加热一定时间获得。Luben N A等人［4］在研究了β-乳球蛋白在低pH的条件下持续加热，蛋白质水解为缩氨酸，部分的缩氨酸存在于蛋白质淀粉样纤维中，并且淀粉样纤维可以极大提高地原蛋白液的粘度。因此，研究蛋白质淀粉样纤维如何改变蛋白质溶液和凝胶的结构属性有较强的现实作用和意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芸豆 广州好又多超市购得的优质芸豆；刚果红 分析纯，Sigma；其它试剂 均为国产分析纯。

过滤膜 Millipore；离心机 HITACHI；分光光度计 F-4500，HITACHI；流变仪 RS-600，HAAKE；扫描电镜 XL-30，PHILIPS。

1.2 实验方法

1.2.1 芸豆分离蛋白的制备 芸豆分离蛋白的制备参考EI-Hady等人［5］的制备蛋白的方法，并且稍加改变。红芸豆在4℃的NaHCO3溶液中浸泡15h，人工脱去芸豆外皮，将芸豆种子放入冻干机冻干。将冻干的豆子粉碎，使用正己烷将豆粉脱脂三次，将脱脂的豆粉溶解在蒸馏水中，搅拌均匀后，用2mol/L NaOH调pH至8。将蛋白溶液离心后的上清液用2mol/L HCl调pH至4.5。在相同的条件下再次离心，将离心后沉淀溶解后调pH至7，最后经过透析，冷冻干燥后即得芸豆分离蛋白。

表1 芸豆蛋白溶液的表观现象和性质参数

1.2.2 淀粉样纤维蛋白的制备 制备芸豆淀粉样纤维蛋白，将芸豆蛋白加入到经Millipore过滤膜处理的溶液中，配制浓度2%的蛋白质溶液，搅拌约1h，将离心机离心后的蛋白质上清液加入到小玻璃试管中，在80℃分别水浴加热10h和24h。

1.2.3 刚果红的吸收测定 配制新鲜的刚果红储液（pH7.0）。测量前，将刚果红储液稀释成一定浓度的刚果红工作液，将样品溶液加入到4mL的刚果红工作液中，充分振荡均匀，静置，使用分光光度计在400～700nm的波长范围内扫描，所有的样品测量都使用1cm的石英比色皿，每个样品重复测量三次。

1.2.4 蛋白溶液流粘度的测定 将未加热的6%的蛋白液、加热搅拌的蛋白液和经过加热处理的2%的蛋白质溶液按照不同的比例混合，在流变仪上操作，测量混合液体的粘度。转盘直径 27.83cm，间距1mm。剪切速率0.01～100s-1，每个样品剪切程序设置为120s，每4s记录一个数据点，每个样品粘度重复测量三次。

1.2.5 凝胶性质的测定 将上述未加热的蛋白液和经过加热处理的蛋白质溶液按照不同的比例混合，在流变仪上操作测量混合液体加热后形成凝胶的模量的变化。样品溶液经过加热处理后，在常温的条件下对形成的蛋白质凝胶进行控应变扫描。

1.2.6 扫描电镜 使用扫描电镜在常温下观察蛋白质凝胶的微结构。根据Muller等人［6］的方法制备样品，稍有改变。按照不同比例添加淀粉样纤维蛋白，配制总浓度为6%的蛋白溶液，80℃水浴加热1h，形成蛋白质凝胶。将形成蛋白质凝胶的样品切成小立方块。在戊二醛中浸泡做前固定，再用四氧化锇做后固定，洗脱干净后，用不同梯度的乙醇脱水，样品在二氧化碳临界点干燥处理，最后将样品喷金，保持样品干燥待观察。操作电压20kV，电流8mA。

2 结果与讨论

2.1 芸豆分离蛋白

芸豆分离蛋白（KPI）和淀粉样纤维蛋白（fibrils）的比例，F0（1/0）、F1（0.75/0.25）、F2（0.5/0.5）、F3（0.25/0.75）和F4（0.5/0.5），其中F1、F2和F3溶液中的淀粉样纤维使用的是加热10h的2%的蛋白质溶液，F4使用的是加热24h的1%的蛋白质溶液。配制不同浓度的分离蛋白使得样品的最终的蛋白质总浓度为6%。

表1显示了芸豆分离蛋白和淀粉样纤维蛋白不同比例混合以后，形成的溶液和再次加热形成凝胶的属性参数变化。可以看出，在蛋白质浓度相同的情况下，蛋白质的淀粉样纤维所占的比例越高，所形成凝胶的透明度越浑浊。蛋白质溶液的粘度和凝胶的弹性模量也是随着淀粉样纤维比例的增大而增高。

在6%的蛋白溶液中，当没有淀粉样纤维蛋白存在时，溶液是透明的，当存在淀粉样纤维蛋白时，溶液变得浑浊，并且随着淀粉样纤维蛋白的浓度增加，溶液的浑浊程度也在加大，由澄清透明的颜色变成了橙黄色。在加热形成蛋白质凝胶后，随着淀粉样纤维浓度的加大，凝胶的外观颜色进一步变浑浊，浑浊度逐渐增加。不同淀粉样纤维蛋白浓度下的溶液表观，溶液颜色和浊度的变化可能是淀粉样纤维蛋白的加入增大了蛋白质聚集的粒径，产生更多的折射，从而在视觉上产生溶液的浑浊程度随着淀粉样纤维浓度的增大而增大的现象。

2.2 刚果红的吸收

图1中细实线为刚果红的吸收曲线，虚线为加热10h蛋白液的吸收曲线，粗实线为样品经刚果红染色后的吸收曲线。蛋白质淀粉样纤维后的一个显著的特征就是使用刚果红标定分析［7］，观察刚果红的吸收峰是否向红外方向发生移动。从图1的波长扫描可以看出，当蛋白质溶液被加热10h以后，热聚集的芸豆蛋白质刚果红吸收曲线发生了明显的移动。这是典型的淀粉样纤维蛋白存在的特征，说明了芸豆蛋白在热处理后发生了淀粉样纤维的聚集。溶液中的淀粉样纤维蛋白质与刚果红发生反应，改变了蛋白质的构象，从而使吸收波长发生了变化。

图1 淀粉样纤维化的刚果红吸收峰偏移

2.3 淀粉样纤维蛋白的凝胶效果

蛋白质形成凝胶硬度的强弱可以通过流变仪测量表示。在芸豆蛋白质的凝胶中，五个不同比例的淀粉样纤维形成的蛋白质凝胶。蛋白质的总浓度为6%，在80℃条件下加热1h后，从图2中可以看出，加入不同浓度淀粉样纤维后形成的凝胶强度相差很大（数据如表1所示）。淀粉样纤维蛋白占总比例75%的F3与没有淀粉样纤维蛋白的F0在总蛋白浓度相同的情况下比较，形成凝胶的弹性模量F3是F0的两倍多。

图2（a）的结果说明了在加入淀粉样纤维的蛋白质溶液加热形成凝胶后，蛋白质胶体内部交联的网络结构发生了变化，加入的淀粉样纤维增大了凝胶网络之间的连接。淀粉样纤维改变了蛋白质内部的构象，形成凝胶后可能在胶体网络之间形成了新的化学键，使之形成更加稳定的结构。图2（b）的结果说明了蛋白质凝胶在较高的剪切应变作用下，超过了凝胶结构的承受，凝胶开始破裂，这一现象导致tan（δ）的数值随着剪切应变的加大而增高。

图2 不同比例的淀粉样纤维的弹性模量和tan（δ）的示意图

2.4 淀粉样纤维的粘度测量

粘度是反映流体性质的一个重要参数。蛋白质溶液的粘度反映了蛋白质加入到溶剂后的溶液的物理性质，粘度大的说明溶液的流体阻力大。将不同淀粉样纤维蛋白比例的溶液配制好，进行粘度测量。如图3所示，蛋白质溶液的粘度随着剪切速率的增大而减小，在相同的剪切速率下，溶液的粘度随着蛋白质淀粉样纤维的浓度增大而增大。蛋白质溶液的粘度随着淀粉样纤维蛋白的比例增大而增加，而相同比例浓度的蛋白质淀粉样纤维溶液，加热10h的蛋白质溶液的粘度要低于加热24h的溶液粘度。淀粉样纤维蛋白加入到蛋白溶液后将使整个溶液体系变复杂，而粘度的增大可能是因为蛋白质溶液中加入了淀粉样纤维蛋白后增大了分子之间彼此的相互作用，从而改变了溶液的粘度。

图3 不同比例淀粉样纤维蛋白溶液的粘度

2.5 扫描电镜

将F0和F2条件下形成的蛋白质凝胶制备成可用于扫描电镜观察的样品。图4显示F0和F2为两种不同结构类型的凝胶。在（a）图中，F0溶液中仅有芸豆分离蛋白而没有添加淀粉样纤维蛋白凝胶，其结构单一，彼此之间的相互交联相对不强。图（b）显示了存在淀粉样纤维蛋白的凝胶，并存的多种结构形成的胶体具备较强的凝胶强度。

图4 扫描电镜下F0和F2形成的蛋白质凝胶微观形态（10000×）

表1中的结果显示，流变仪测定F0形成的凝胶强度要弱于F2形成的凝胶强度。说明淀粉样纤维蛋白可能形成连续的网络结构，大量的不同结构增强了胶体的强度，增加了彼此之间的相互作用，形成更加稳定的蛋白质构造。在添加了淀粉样纤维蛋白后，意味着胶体包含大量的不同结构要多于不加淀粉样纤维蛋白的胶体，更容易形成蛋白质凝胶，而不加淀粉样纤维蛋白要形成相同强度的胶体意味着需要更高的蛋白质浓度。

3 结论

在较低的离子强度和pH条件下，溶液中的芸豆蛋白质聚集后形成线性纤维状。通过将不同比例的淀粉样纤维蛋白添加到芸豆分离蛋白溶液中，可以明显提高溶液的粘度和所形成凝胶的强度。

实验结果显示了蛋白质淀粉样纤维可以改变蛋白质溶液和由此形成凝胶的新的属性，这些属性的改变可以使蛋白质原料应用更广，开发出一些新的应用领域。蛋白质淀粉样纤维的程度依赖于加热时间，较长时间的加热会提高蛋白质淀粉样纤维的程度和形成纤维的长度。但是影响蛋白质的淀粉样纤维程度的还有很多的因素，将使蛋白质溶液系统变得更加复杂，至于各个因素的协调作用效果，有待进一步研究。

［1］Yin S W，Tang C H，Wen Q B，et al.Functional properties and in vitro trypsin digestibility of red kidney bean（Phaseolus vulgaris L）protein isolate：effect of high-pressure treatment［J］. Food Chemistry，2008，110（4）：938-945.

［2］Tang C H.Thermal denaturation and gelation of vicilin-rich protein isolates from three Phaseolus legumes：a comparative study［J］.Food Science and Technology，2008，41（8）：1380-1388.

［3］Carlsson Kanyama A.Climate change and dietary choiceshow can emissions of greenhouse gases from food consumption be reduced［J］.Food Policy，1998，23（3-4）：277-293.

［4］LubenN A.MultipleStepsduringtheFormation of β-Lactoglobulin Fibrils［J］.Biomacromolecules，2003，4（6）：1614-1622.

［5］Abd El-Hady E A，Habiba R A.Effect of soaking and extrusion conditions on antinutrients and protein digestibility of legume seeds［J］.LWT-Food Science and Technology，2003，36（3）：285-293.

［6］Muller W H，et al.Field-emission scanning electron microscopy of the internal cellular organization of fungi［J］. Scanning，2000，22（5）：295-303.

［7］Morshedi D，Rezaei-Ghaleh N，Ebrahim-Habibi A，et al. Inhibition of amyloid fibrillation of lysozyme by indole derivatives -possible mechanism of action［J］.FEBS J，2007，274（24）：6415 -6425.

［8］Bolder，Vasbinder S G，Sagis A J，et al.Heat-induced whey protein isolate fibrils：conversion，hydrolysis and disulphide bond formation［J］.International Dairy Journal，2007，17（7）：846-853.

Study on the properties of amyloid fibrils in kidney bean protein solution and gelation

ZHANG Ye-hui1，HUANG Li-hua2，WEN Qi-biao1，TANG Chuan-he1，*
（1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.School of Architecture，Environment and Food Engineering，Guangzhou City Polytechnic，Guangzhou 510405，China）

How protein fibrils could be used to modify the structural properties of concentrated kidney bean protein solutions and gelations were studied.Fibrils could be prepared by being heated at low pH and ionic strength.Fibrils could lead properties to take place big changes of solutions and gelations.The properties of fibrils were tested using congo red.Solutions viscosity and gelations strength were tested by rheometer.Amyloid fibrils microstructure could be observed by scanning electron microscopy.

kidney bean protein；heating assemble；amyloid fibrils；changes of properties

TS231

A

1002-0306（2010）11-0072-04

2009-07-31 *通讯联系人

张业辉（1979-），男，在读博士研究生，研究方向：植物蛋白改性研究。

国家自然科学基金（20876057）。