陈毅坚,钟文武,余正云

(1.云南民族大学化学与生物技术学院,云南昆明 650031; 2.西双版纳职业技术学院,云南西双版纳 666100)

食用块菌形态特征和抗氧化性能研究

陈毅坚1,钟文武1,余正云2

(1.云南民族大学化学与生物技术学院,云南昆明 650031; 2.西双版纳职业技术学院,云南西双版纳 666100)

对产于云南的块菌的形态特征进行了研究,观察了子实体、子囊孢子的形态,并将块菌的水提取液和醇提取液进行了清除DPPH自由基、清除超氧负离子自由基、清除羟基自由基的抗氧化性能实验。结果表明,块菌有大而壁厚的子囊孢子,人工培养时不易萌发。块菌的水提取液和醇提取液都有较好的抗氧化性能,醇提取液的抗氧化性能优于水提取液。

块菌,共生型真菌,形态特征,抗氧化性能

1 材料与方法

1.1 实验材料

云南块菌 购自汇和公司,标本经鉴定后储存于云南民族大学化学与生物技术学院微生物实验室;云南块菌不同溶剂提取物 a.蒸馏水提取液 (将10g块菌子实体切碎,加入 50mL蒸馏水,沸水浴加热20min,过滤备用);b.50%醇提取液 (将 10g块菌子实体切碎,加入 50mL 50%的乙醇溶液,室温下浸泡一周,过滤备用);c.95%醇提取液 (将 10g块菌子实体切碎,加入 50mL 95%的乙醇溶液,室温下浸泡一周,过滤备用);鲜松针培养基 洋芋 20%、鲜松针 3%、麦芽糖1%、葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、MgSO40.05%、琼脂 2%;PDA培养基 200g马铃薯、葡萄糖10～20g、琼脂 17～20g、水 1000mL;邻二氮菲,H2O2, FeSO4,磷酸盐缓冲液,Tris-HCl缓冲液,邻苯三酚, DPPH。

1.2 实验方法

1.2.1 块菌生境和形态描述[12]通过查阅文献资料了解块菌的生态环境特征;观察描述子囊果特征和徒手切片法制子囊孢子显微玻片观察其形态特征和生长状况。

1.2.2 分离培养

1.2.2.1 块菌组织块接种培养 将块菌子实体用70%酒精泡洗数次,再用无菌水冲洗数次,切成 0.5～1.0cm大小,接种于鲜松针和 PDA固体培养基上,于28℃的温箱中培养,观察生长状况。

1.2.2.2 孢子悬浮培养 将用石英砂研磨块菌子实体后离心得到的孢子悬液分别接种于鲜松针液体培养基(pH=7.2～7.4)和 PDA液体培养基 (pH=7.2～7.4)中悬浮培养,摇床转速 120r/min,23～25℃,培养一周后定期进行镜检,观察其生长状况。

1.2.3 块菌提取液抗氧性能的研究

1.2.3.1 提取液清除DPPH·的实验[13-14]配制块菌水提取液,50%乙醇提取液,95%乙醇提取液备用,同时配制 0.0177mmol/L的 DPPH溶液,避光保存备用。分别取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL不同溶剂提取的提取液于试管中,加 2mL所配制的DPPH溶液,混合均匀,补充体积至 4mL,30min后倒入光径为1cm的比色皿中,在 517nm处测定其吸光度值,同时测定提取液样品空白以及不加提取液的空白样的吸光度值。按下式计算其对DPPH的抑制率：

抑制率 (%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

其中：Ai=2mL DPPH溶液 +提取液的吸光度值;Aj=2mL提取液 +2mL乙醇的吸光度值;A0= 2mL DPPH溶液 +提取溶剂的吸光度值。

1.2.3.2 提取液清除超氧负离子自由基的实验[15]取 5.6mL Tris-HCl缓冲液于试管中,加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL的提取液混匀后,25℃的水浴锅中保温 10min,取出后立即加入在 25℃水浴锅中预热的邻苯三酚 0.3mL,迅速摇匀,倒入光径为 1cm比色皿,每隔 30s测定吸光度 1次,平行测定 3次,取平均值,计算抑制率,同时做空白实验。

抑制率(%)=(A样-A0)/A0×100%

1.2.3.3 提取液清除羟基自由基的实验[16]在试管中分别加入 2mL pH7.4的磷酸盐缓冲液,1mL 1.5mmol/L的邻二氮菲溶液,充分混匀后加入 1mL 1.5mmol/L的 FeSO4溶液,加入后立即混匀,分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL的提取液,混匀后再加入 1mL 0.02%～0.03%的 H2O2,最后补充体积至8mL,同时做样品空白和试剂空白 (A0),于 37℃保温1h,测定 510nm下的吸光度,重复 3次,计算平均值。

OH-的清除率 (%)=(A样-A0)/A0×100%

式中：A样为提取液并扣除样品空白后的吸光度。

2 结果与分析

2.1 块菌生态环境特征及形态特征

实验材料采自云南楚雄永仁,块菌子实体生于云南松 (Pinas yunnanensis)、高山松 (Pinas densata)、麻 栎 (Quercus acutiss im a)、高 山 栎 (Quercus sem icarpifolia)、青冈栎 (Cyclobalanopsis glauca)的混交林下土层中,土质疏松微砂粒化、瘠薄,含少量的腐殖质,平均气温 18～20℃,每年 11至次年 2月为采收期。

云南块菌的子囊果 (子实体)多呈球形或半球形,直径 1.5～3.5cm,单重 5.8～11.7g,黑褐色,表面布以大小不等的疣突,放置时发出浓郁的香甜气味,子囊果质硬,较耐储存,采收后可埋于干沙中一段时间。切开子实体可见一些乳白色的菌脉,制徒手显微切片观察可见块菌的子囊较大,一般含有 2、3或 4个孢子,子囊孢子椭圆形,大小为 32～48×21～35μm,褐色,表面有较多的突起,有较厚的孢子壁,结果见图1。

图 1 菌子囊及子囊孢子(a～d)和菌在液体培养液中孢子的生长状态块(e、f)

2.2 分离培养实验结果

通过比较块菌组织块接种培养和孢子分离培养的结果,可见块菌组织块在固体培养基上不易生长,培养物极易被污染,这与块菌为共生菌有关。而孢子分离悬浮于松针培养基中培养的有絮状沉淀产生,镜检观察后,发现有无性孢子产生,直径大小为8～11μm。

2.3 块菌提取液抗氧化性能的研究

2.3.1 块菌提取液清除DPPH自由基的实验 用不同溶剂的块菌提取液做清除DPPH自由基的实验,依据公式计算出抑制率,不同溶剂不同浓度提取液的清除效果见图2。

由图 2可知,块菌水提取液和 95%的乙醇提取液对 DPPH自由基有较好的清除效果 (最高值达80%),随着浓度的增加清除率也在增加;且在低浓度的范围内,清除率的增加幅度较大,当浓度增加到一定时,清除率增加不明显。50%的乙醇提取液对DPPH自由基的清除效果相比而言明显低于水提液和 95%乙醇提取液的清除效果。

图2 块菌不同溶剂提取液清除DPPH·结果示意图

2.3.2 块菌提取液清除超氧负离子自由基的实验不同溶剂块菌提取液清除超氧负离子自由基的结果见图3。

图3 块菌不同溶剂提取液清除超氧负离子自由基结果示意图

由图 3可知,块菌 50%乙醇提取液对超氧负离子自由基几乎没有清除效果,而在水提液和 95%乙醇提取液中,95%的乙醇提取液对超氧负离子自由基的清除效果较好,在较低浓度下,清除率增加的幅度较小,而随着浓度的增加,清除率也明显增大。实验表明,水提取液和 95%乙醇提取液对超氧负离子自由基的清除能力为：95%乙醇提取液 ＞水提取液。

2.3.3 块菌提取液清除OH自由基的实验 块菌不同溶剂提取液清除羟基自由基的结果见图 4。

图 4 块菌不同溶剂提取液清除OH·自由基结果示意图

由图 4可知,块菌水提取液、50%乙醇提取液和95%乙醇提取液对羟基自由基都有较好的清除效果(最高值达 80%以上),在较低浓度下清除率增加幅度较大,而在较高的浓度下,清除率增加不明显。95%和 50%的乙醇提取液在加入体积 0.5mL时有相同的抑制率。

3 讨论

通过观察块菌的子囊果的孢子的形态特征可以得知,块菌的子囊孢子有较厚的孢子壁,普通的固体培育法不易使孢子萌发,悬浮培养时孢子易萌发,因此提示我们,采用人工和半人工模拟栽培时可使用悬浮培养的孢子悬液作为接种剂可取得较好的效果。

通过块菌不同溶剂提取液抗氧化性能不同测定方法的比较研究,可看出不同溶剂的块菌提取物都有较好的抗氧化效果,而醇溶剂的提取物效果较好,因此对块菌的食用加工方面,可制作出保健酒或酒精饮料等产品,以提高块菌资源利用的附加值。在今后的进一步研究中,将对块菌活性成分进行深入的研究,可将其活性成分提取纯化出来,并鉴定其结构,用做其它食品或化妆品的添加物,还可开发为抗肿瘤、抗衰老、调节免疫功能的药物等,这将对我省块菌资源的可持续利用和天然抗氧化剂的开发有着积极的作用。

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Study on morphological character and antioxidant activity of edible truffle

CHEN Y i-jian1,ZHONGW en-wu1,YU Zheng-yun2
(1.College of Chemistry and Biological Technology,Yunnan University of the Nationalities,Kunming 650031,China; 2.Xishuangbanna College of Professional Technology,Xishuangbanna 666100,China)

The m orp holog ica l cha rac te r of ed ib le truffle was s tud ied through the obse rva tion of fruiting body and ascosp ore in this p ap e r,and its antioxidant ac tivity was a lso s tud ied by tes ting c leaning DPPH·free rad ica l, sup e roxide rad ica l and hyd roxy rad ica lw ith the wa te r extrac t and the a lcohol extrac t of truffle.The result showed tha t truffle ascosp ore had la rge and thick wa ll,which p revented from its ge rm ina tion in a rtific ia l culture.The wa te r extrac t and the a lcohol extrac t of truffle both have be tte r antioxidant ac tivity,and the a lcohol extrac t is sup e rior to the wa te r extrac t in antioxidant ac tivity.

truffle;sym b iotic fungus;m orp holog ica l cha rac te ris tic;antioxidant ac tivity

TS219

A

1002-0306(2010)02-0139-03

块菌是真菌纲 (Eumycota)、子囊菌亚门(Ascomycotina)、块 菌 目 (Tuberales)、块 菌 科(Tuberaceae)、块菌属 (Tuber)[1]的外生菌根型真菌。迄今全球描述的块菌属真菌在 60种以上,主要分布在北温带的森林地区和南温带的森林地区,少数分布在干旱的荒漠、半荒漠地带和亚热带林区。欧洲地区是块菌的发祥地,法国、意大利、西班牙等为块菌的主要分布区。块菌在中国主要分布在西南的四川和云南,海拔 1600～2600m的针阔混交林或针叶林下,以及西北的新疆和西藏等地[2]。到目前为止,在我国发现的块菌种类估计有 25种之多。块菌有很高的营养价值和多种药物功能,近年来有很多的研究报道其所含活性成分有α-雄烷醇、神经酰胺、块菌多糖等,这些化合物具有抗肿瘤、免疫调节、保肝、抗衰老等活性,块菌的这些良好保健作用也因此受到了人们的关注[3-11]。但由于块菌是菌根共生型真菌,有特殊的生境要求,故产量少,目前出口需求量大,我们云南省的一些贸易公司每年都向产地收购后直接出口欧洲国家,对块菌资源的利用较粗放,这不利于资源的保护和有较高经济价值的利用。本文开展对块菌的生物学特性和抗氧化性能的比较研究,为探究块菌抗衰老、保肝健体的机理,也为今后更好地利用块菌资源,开发附加值较高的保健产品提供基础资料。

2009-03-10

陈毅坚(1966-),女,副教授,研究方向：微生物资源的开发和利用。