沈 晗,孙宝国,廖永红,肖 阳

(北京工商大学化学与环境工程学院,北京 100048)

猪肉复合酶解及其热反应产物挥发性成分分析研究

沈 晗,孙宝国,廖永红＊,肖 阳

(北京工商大学化学与环境工程学院,北京 100048)

比较 14种蛋白酶酶解猪肉水解度大小与其热反应产物风味,筛选出水解度较大,风味较好的 Trypsin、Papain、Neutrase(powder)、Novozymes Flavorase、Novozymes Protamex、Alcalase 2.4L、Protex6L酶进行L18(37)正交实验,得水解度最大的复合酶组合为A3B3C3D2E3F2G3,其最适酶解条件为加酶量 250U/g猪肉、60℃、自然 pH、2.5h,GC-MS分析酶解物热反应肉味香精挥发性成分的主要风味物质为醇类和醛类,其中苯甲醛与糠醛与肉味关系密切。

蛋白酶,酶解,水解度,热反应,GC-MS

1 材料与方法

1.1 实验材料

里脊猪肉 市售;各种蛋白酶制剂 庞博和诺维信酶制剂有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白酶活力测定 Folin-酚法[5]。

1.2.2 总氮含量测定 凯氏定氮法[6]。

1.2.3 游离氨基氮测定 甲醛滴定法[7]。

1.2.4 水解度 (DH)测定[8]DH(%)=h/htot×100%

式中：h-水解后每克蛋白被裂解的肽键毫摩尔数;htot-每克原料蛋白的肽键毫摩尔数。

1.2.5 猪肉酶解 定量称取猪肉糜 (肉∶水 =2∶1, m/v),用 0.1mol/L的NaOH或 HCl调至蛋白酶作用最适 pH,添加一定量酶,在最适温度下的水浴摇床中酶解一定时间,95℃灭酶 5min,冷却。

1.2.6 热反应 将一定量还原糖加入猪肉酶解物中,110℃热反应 2h,即得肉味香精,冷却,编号,待评价。

晚上回到家，我对颖春说了县里地震的事，颖春却什么也不说，只是一个劲地笑。我觉得她笑得有些奇怪，便问，你笑个什么鬼哟？颖春点着我的额头说，地震好啊！那些人倒台了，不是正好给你留下位置了吗？

1.2.7 肉味风味评价 选 10个评分人,其中 3名为专业人士,肉味强弱分 10等级,从弱到强分别计1～10分,打乱样品顺序由评分人按标准方法单独评分,专业人士得分权重占 0.6,其他评分人得分权重占 0.4,统计评分结果。

1.2.8 GC-MS分析肉味香精挥发性风味物质 取5g肉味香精于 50℃用 SP ME(固相微萃取)法萃取30min,利用 GC-MS对其挥发性风味物质进行分析,其中 GC条件为：柱温 250℃,不分流,进样量为1.0mL/min,H240.0mL/min,Air 450mL/min,程序升温起始 50℃,保留 3min,以 6℃/min升至 200℃,保留 2min,再以 10℃/min升至 300℃,保留 2min。

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶活力测定

由于蛋白酶在贮藏过程中,酶活力逐渐丧失,所以对收集到的 14种蛋白酶进行实际酶活力的测定,本实验酶添加量均按活力计算。采用 Folin-酚法测定蛋白酶活力,结果见表 1。

表1 14种蛋白酶酶活力测定结果

2.2 单一蛋白酶酶解效果与风味比较

2.2.1 单一蛋白酶酶解效果比较 将14种蛋白酶分别编号 1#～14#,按 1.2.5方法在各酶最适 pH、温度下进行猪肉蛋白酶解,酶添加量见表 2。在不同时间取样测定DH,作各酶酶解时间与DH曲线如图1。

表 2 1#～14#蛋白酶添加量

在酶的作用下猪肉蛋白逐渐被水解,得到的短肽和氨基酸数量不断增加。随着反应继续进行,底物减少,酶解作用减慢,曲线趋于平缓。由图 1可知：4#酶水解作用最强,最大DH达 46.3%,取 1#、4#、5#、7#、8#、10#、13#、14#酶解作用时间为 3h,2#、9#、11#酶解作用时间为 2.5h,3#、6#酶解作用时间为 2h。

图 1 1#～14#蛋白酶DH与时间曲线

2.2.2 单一蛋白酶酶解物热反应产物风味比较 将1#～14#酶酶解猪肉蛋白的酶解物按 1.2.6方法进行热反应,对其产物风味按 1.2.7的方法进行评分统计,将酶解作用的DH大小与对应热反应产物的风味得分比较见图2。

图 2 蛋白酶酶解作用的DH与酶解物热反应风味得分比较

从图 2得知,4#、5#、6#、14#酶解作用 DH较大,且对应的热反应产物风味较好,而 7#、12#、13#酶解作用DH较小,对应热反应产物风味得分却较高,其它酶酶解作用的DH较低,对应热反应产物风味不佳,说明获得较好热反应风味产物与酶种类及其DH大小相关。

2.3 蛋白酶复合及酶解条件优化

不同蛋白酶酶切位点不同,水解度各异,复合蛋白酶解具有比单一酶更高的酶解效率,不仅 DH大,原料利用率高,而且酶解产物种类多、所得酶解液提供种类和数量更多的氨基化合物参与Maillard热反应,可以获得更丰富的风味物质。为了追求原料更高的利用率和良好的风味,本实验选择 4#、5#、6#、7#、12#、13#、14#蛋白酶复合,并进行复合酶解条件优化,以获得最大DH。

2.3.1 蛋白酶复合配比的确定 将 4#、5#、6#、7#、12#、13#、14#蛋白酶重新编号为 A～G,以酶种类为因素、加酶量为水平(见表 3)、DH为指标进行L18(37)正交实验,其它酶解条件为自然 pH、温度 60℃、酶解时间2h,酶解结果见表 4和表 5。

表3 复合蛋白酶酶解因素水平表

从表4的R值可以得出,各酶对DH影响大小的关系是A＞B＞G＞E＞C＞D＞F。最优的复合酶组合为 A3B3C3D2E3F2G3,该酶组合下实测 DH为42.88%,比表 4各实验号的 DH均大,所以证明该组合选择正确。虽然最大复合酶解的DH比 4#单一酶解的DH(46.3%)略低,但复合酶添加量总和为 250 U/g猪肉,仅不到 4#酶解添加量 (508U/g猪肉)的一半,说明复合酶的酶解效率更高。

表 4 复合蛋白酶酶解正交实验结果

表5 复合蛋白酶解DH方差分析

2.3.2 复合酶酶解条件优化 对复合酶(A3B3C3D2E3F2G3)酶解作用的加酶量、温度、pH、时间按表 6所示因素水平进行条件优化,实验结果见表7和表8。

表6 复合酶酶解条件优化因素水平表

从表7的R值可知,各因素对DH的影响作用为加酶量 ＞温度 ＞pH＞时间,加酶量对 DH的影响显著,所以继续提高加酶量可增大DH。最优的复合酶酶解条件是加酶量为 250U/g猪肉、温度 60℃、自然pH、时间 2.5h,该酶解条件下测定的 DH为 43.11%,比表 8各实验号 DH均大,说明该最适酶解条件正确。

表8 复合酶酶解条件优化DH方差分析

2.4 热反应产物风味评价及物质分析

2.4.1 热反应产物风味评价 对复合酶(A3B3C3D2E3F2G3)在最适酶解条件下的猪肉蛋白酶解物的热反应产物按 1.2.7的方法进行风味评价,得分为8.7,产物具有浓郁的猪肉香味,并具有较好的烤香。

2.4.2 热反应产物中风味物质的 GC-MS分析 采用1.2.8方法中的参数对复合酶解热反应产物中的挥发性风味物质进行 GC-MS分析,得 GC-MS图谱,见图 3。收集各峰进行检索,确定风味物质名称及峰面积大小,见表 9。

从表 9可知,肉味香精挥发性风味成分中含量最多的物质是顺式-2,3-氧辛烷、反式-2-戊烯酸乙酯,其次是 3-糠醛、3-环戊烯-1,2-二醇、苯甲醛等,其中糠醛具有肉香味和烤香味,苯甲醛具有苦杏仁味,具有导致气味加成或协同作用的效果,是非常有效的风味修饰剂[9],这两种物质与香精肉味有密切的关系。从物质分类上,醇类最多,有 6种,以 3-环戊烯-1,2-二醇含量最高;其次是醛类,有 5种;其它还有呋喃类、烷烃类、烯烃类等物质。

图3 复合酶解热反应产物的 GC-MS图谱

表 9 复合酶解热反应挥发性风味成分及含量

3 结论

3.1 不同蛋白酶水解猪肉蛋白的 DH不同,酶解物热反应产物风味与酶种类和DH相关。

3.2 复合酶具有比单酶更高的水解效率,为了获得原料最大利用率及较好的热反应产物风味,需使酶解作用的DH最大化。对蛋白酶进行复合得最佳复合酶组合为 A3B3C3D2E3F2G3,其酶解最适条件为加酶量 250U/g猪肉、60℃、自然 pH、2.5h,DH达43.11%。

3.3 对复合酶酶解猪肉蛋白热反应产物进行 SP ME -GC-MS分析,得其主要的风味物质为醇类和醛类,与肉味具有较大关系的风味物质是 3-糠醛、苯甲醛等。

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[9]孙丽平,等 .利用鳕鱼皮蛋白制备热反应型肉香调味基料的研究[J].中国海洋大学学报,2009,39(3)：249-252.

Study on hydrolysis of pork enzymatic hydrolysis by complex proteases and analysis of the volatile components ofMaillard reaction products

SHEN Han,SUN Bao-guo,L IAO Yong-hong＊,XIAO Yang
(School of the Chemical and Environmental Engineering,Beijing Technology and BusinessUniversity,Beijing 100048,China)

By comp a ring the DH and tas te of the14p roteases hyd rolyza tes of p ork p rote in,Tryp s in,p ap a in,neutra l p rotease,Novozym e flavourzym e,Novozym e p rotam ex,a lca lase2.4L and p rotex6L we re se lec ted to be tes ted in orthogona l exp e r im ent.The bes t com b ina tion of the b igges t DH was A3B3C3D2E3F2G3,its op t im um cond ition was p rotease quantity250U/g p ork,60℃,na tura l pH,2.5h.M a illa rd reac tion p roduc ts we re ana lyzed by GC-MS,the flavor subs tances which m a inly we re a lcohol,a ldehydes and so on,furfura l and benza ldehyde had a c lose re la tionship w ith the p orc ine flavor.

p rotease;enzym a tic hyd rolys is;DH;M a illa rd reac tion;GC-MS

TS251.1

A

1002-0306(2010)02-0104-04

肉是人类的重要食物,肉香味是人类饮食中最重要的香味之一,热反应是肉味香精形成的最主要的途径之一[1]。通过蛋白酶酶解肉蛋白可以获得很多肉味前体物质,如游离氨基酸、胺、多肽等[2],这些氨基化合物与羰基化合物可进行羰氨反应(Maillard热反应,后简称热反应),产生醛、酮、酯类等具有特殊风味的物质[3]。蛋白酶分内切酶和外切酶,不同的蛋白酶具有不同的酶切位点,酶解产生的氨基化合物也不同,复合蛋白酶解不仅使得酶解效率大大提高,而且提供更多不同种类和数量的氨基化合物,通过热反应产生性质和种类不同的风味物质,形成不同的风味。本实验通过比较 14种蛋白酶的水解度(DH)与酶解产物热反应产生肉风味的强弱筛选出 7种蛋白酶进行复合,并对复合蛋白酶的酶解条件进行优化,通过 GC-MS对酶解物热反应肉味香精风味物质进行分析[4],比较酶解与风味的关系。

2009-08-07 ＊通讯联系人

沈晗 (1985-),男,硕士研究生,研究方向：食品生物技术。

“十一五”国家科技支撑计划项目(2007BAK36B05)。