刘 宾，刘 颖，义志忠，赖毅东，彭喜春，吴希阳,*

(1.暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632；2.东莞市质量计量监督检测所，广东 东莞 523120)

适体在抗生素残留检测中的应用

刘 宾1，刘 颖1，义志忠2，赖毅东2，彭喜春1，吴希阳1,*

(1.暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632；2.东莞市质量计量监督检测所，广东 东莞 523120)

目前虽然已有氯霉素、新霉素等抗生素抗体应用于食品检测中，但作为半抗原，抗生素抗体制备困难。抗生素种类繁多，抗体使用成本高，大样本筛查困难，灵敏度低等缺陷限制了抗体在检测中的应用。而DNA或RNA适体被称作化学抗体，可以高特异、高亲和力地同靶分子结合。与传统免疫抗体相比，在筛选制备、稳定性及应用等方面都显示出独特的优势。本文对适体的发现、特点及筛选方法进行综述，介绍适体在抗生素及其他小分子检测中的主要应用技术，并对适体的检测应用进行展望。

适体；抗生素；传感器；酶联检测；aptazyme

Abstract：Although it is difficult to immunize animals with antibiotics as half-antigens for antibody generation, immunoassay techniques have become the most popular methods for detecting antibiotics in foods and environment, such as commercially available chloramphenicol and neomycin test kits. Nevertheless, actual applications of immunoassay techniques are limited due to the wide variety of antibiotics, high cost of preparing antibodies against some antibiotics, difficulties in large-scale screening of samples and low sensitivity of these techniques. Aptamers, also named chemical antibody, are single stranded DNA or RNA ligands,which can be bound to different targets from a huge library of molecules containing randomly created sequences with high specificity and affinity. Aptamers have some advantages over conventional immune antibodies, such as easyin vitroselection by their target molecules, the possibility of chemical synthesis and modification and high stability. This paper describes the finding history of aptamers, methods for selecting them, their characteristics and techniques established based on them for the detection of antibiotics and other small molecules. Furthermore, application perspectives of the aptamers based detection techniques are proposed.

Key words：aptamers；antibiotics；sensors；enzyme-linked immunosorbent assay；aptazyme

抗生素在畜禽的饲料添加剂中被广泛使用，并在动物基本治疗中滥用，使得动物源性食品中抗生素残留问题成为食品安全关注的焦点之一。人体摄入含有抗生素残留食品后，可能导致体内细菌对抗生素的耐药性增加，造成人体微生物环境平衡的紊乱和失调，情况严重的还会造成中毒反应或致畸致残。

目前抗生素检测方法主要包括微生物法、理化法、免疫法。微生物法简单直观，但测定时间长且结果误差较大。理化法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色谱法、气相色谱法、比色法、荧光分光光度法等，虽然敏感性较高，但需要昂贵的设备，检测程序较复杂，费用较高。酶联免疫分析法(ELISA)是免疫检测法的主要形式，具有操作简单、灵敏、特异、快速、不需要昂贵的仪器等优点。ELISA法检测抗生素有诸多优点，特别是抗体针对特定抗生素的特异性和高灵敏度是其他方法所不能比拟的。但ELISA不可避免地存在一些缺陷：对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应，分析分子质量很小的化合物或不稳定的化合物有一定的困难。由于多数抗生素属于半抗原，导致抗体的制备困难，成本高，应用范围受到免疫原性限制，无法直接通过动物免疫得到相应抗体，极大限制了ELISA在抗生素检测中的应用。基于这些原因，寻求抗体的有效替代物成为分子生物学技术研究的热点之一。其中，作为单链小分子RNA、DNA的适体分子(aptamer)具有抗体无可比拟的优越性，而且成为了药物筛选、诊断、基因治疗各领域最具潜力的分子工具[1-2]。

表1 寡核苷酸适体与抗体的比较[5-6]Table 1 Differences between aptamers and antibodies

1 适体概述

寡核苷酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)[3-4]从体外筛选得到的，能与相应配体专一性紧密结合的一类单链寡核苷酸，又称为适体(aptamer)。适体与靶分子的亲和力非常高[3](解离常数可达nmol/L级或pmol/L级)，而且特异性极强(可分辨抗生素分子中一个羟基的不同)。

1.1 适体特性

寡核苷酸适体不但和抗体一样能与靶分子高效、专一地结合，而且具有许多连抗体都无法比拟的优点，见表1。

1.2 抗生素适体

抗生素种类众多，且大部分属于半抗原，作为免疫原获得每一种抗生素的抗体比较困难。而食品中所含抗生素残留非常复杂，尝试筛查每种抗生素的成本很高，且无法同步检测。如表1所述，由于单链核酸可形成三维结构的多样性以及适体与配体之间相互作用力的多样性，理论上自然界中的绝大多数物质(各种有机小分子、生物大分子、细胞器、细胞、甚至是整个组织等)都可以筛选到相应的核酸适体[1]，得到相应适体后可化学合成，使用成本低。所以适体可以广泛的应用于食品中各种抗生素的检测。迄今为止，已有多种抗生素的适体序列发表，见表2。

表2 部分抗生素适体Table 2 Selected aptamers for antibiotics

2 适体的分析应用

核酸适体在很多领域都有应用。根据适体的特性，已经应用于治疗、诊断和新药研发方面，而适体的高亲合力、严格的识别能力和反应的特异性，以及其靶分子范围的广泛性，使得适体非常适合检测和诊断[16]。适体与靶分子的结合类似抗原与抗体形成的复合物，其结合信号可以通过多种方式表现，可通过标记物检测结合信号，如酶标记、放射性标记、荧光标记与生物素标记，另外还可应用流式细胞技术、传感器、荧光偏振、分子灯塔以及毛细管电泳等检测手段，其应用的广泛性远胜过抗体[17-18]。

适体作为检测方法中的识别分子或报告分子，已有相当广泛的应用，如环境中有害物质的检测，食品中化学物质和微生物检测，以及凝血酶、生长因子的诊断应用等[19-21]。作为食品安全监测的重要指标，抗生素的适体法检测也有报道。根据适体与靶分子结合后传出信号和检测手段的不同，本文将分3类介绍已经发表的基于适体的检测方法。

2.1 适体生物传感器

传感器是一种能够连续和可逆地进行分子识别的装置，适体能与靶分子高特异性、高亲和力的结合，可以作为核酸适体传感器中的识别分子。以适体为基础的新型生物传感器和生物分析方法在近年有较大进展。相对传统的抗体，作为识别元件的适体在生物传感器中应用展现出更大的优势。适体分子小、化学稳定性高、成本低，更重要的是适体用于传感器结构设计时，更加灵活、方便，引导了新型高灵敏度和选择性生物传感器的方向[1]。

相对于抗体，适体应用于传感器有很多优势。作为DNA的适体通常有更高的化学稳定性。另外，适体可耐受重要的构想改变，而且不影响与靶分子的结合，这为具有高灵敏度和选择性的新型生物传感器的设计提供了更大的灵活性。适体的靶分子不受免疫原性限制，特别是对抗生素一类的小分子[5]。目前已经筛选出K+、ATP、多肽和蛋白，甚至是细胞和细菌的适体[22-25]，为以适体为基础的新型生物传感器应用到诊断、反生物恐怖、环境检测和食品分析等领域提供了理论基础[26]。

根据信号收集方法的不同，适体生物传感器分为电化学、光学和压电晶体适体传感器，其中光学和电化学传感器的应用较多。

2.1.1 光学适体传感器

光学适体传感器又包括光纤适体生物传感器、消失波光纤生物传感器、表面等离子共振适体传感器、荧光适体传感器4种形式，已有研究分别用于新霉素B、凝血酶、生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、人IgE的检测，其中荧光适体传感器的应用最广[26-29]。

表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)技术[11]属于光学传感器技术的一种，通常是将适体分子固化在以石英或玻璃为载体的金属(通常为金)膜表面，加入待测目的物，两者的结合使金属膜与溶液界面的折射率上升，导致共振角度的改变。如果固定入射光角度，就能根据共振角的改变程度对待测目的物进行定量分析，该方法无需标记，十分方便。

de-los-Santos-alvarez等[11]利用SPR技术设计了新霉素B检测的传感器。新霉素B适体为RNA，为防止RNA酶的降解，先将该适体2’位甲基化。新霉素B通过化学反应固定到金传感器表面，而不是传统传感器中固定适体在上面，当适体溶液流过传感器表面时，电阻光谱会发生变化。样品中新霉素B的含量越高，与固定的新霉素B结合的适体就越少，所检测到的光信号就越低，反之越高。用表面等离子共振技术所制作的生物传感器，检测修饰后的适体对靶分子的亲和力没有明显的减弱，检测新霉素B的线性范围为10nmol/L～100μmol/L，结果表明适体传感器可以高灵敏度地检测抗生素类。

荧光适体生物传感器主要是用荧光基团标记核酸适体，基于目标分子和核酸适体作用后产生的荧光偏振或者荧光强度的改变来检测目标分子；或者将荧光基团和猝灭基团分别标于核酸适体上，通过将目标分子引入到体系中后荧光信号的改变来实现对待测物的定量分析。Su等[30]利用荧光标记的核酸适体(FDNA)和猝灭剂修饰的一小段互补寡核苷酸(QDNA)设计了一个开关装置(图1)。当目标分子(ATP)不存在时，核酸适体与QDNA 双链结合，荧光基团与猝灭基团接触引起荧光猝灭；而当目标分子存在时，核酸适体将优先和目标蛋白分子形成复合物，QDNA从荧光标记的核酸适体表面解离出来，荧光信号得到极大的增强。ATP浓度越高，信号强度越大。

图1 荧光法检测ATP示意图[30]Fig.1 Scheme for ATP detection by the method of fluorescence

2.1.2 电化学适体生物传感器

电化学适体生物传感器是由固定了适体的电极和电化学活性识别元素构成。首先在适当的温度、pH值和离子强度条件下将适体固定到电极表面，将待测目的物加入电极表面，目的物与适体作用，从而导致电极表面结构的变化；然后通过检测电极表面电活性识别元素的电信号，达到识别和鉴定靶物质的目的[30-32]。

Kim等[33]筛选出土霉素的DNA适体，并发明了电化学传感器用于检测土霉素。首先将ssDNA固定至金交叉阵列(interdigitated array，IDA)的电极芯片上，以Fe(CN)6－3为转能器，当土霉素存在并随浓度的变化时会产生不同大小的电流，以此定量土霉素的浓度。此传感器检测土霉素浓度的线性范围为1～100nmol/L。delos-Santos-lvarez 等[34]选用 FIS(faradaic impedance spectroscopy)作为信号换能器，检测牛奶中的新霉素B，线性范围为25～2500μmol/L，50μmol/L时回收率为102%，200μmol/L时为109%。

图2 适体电化学传感器示意图Fig.2 Scheme for an aptamer based electrochemical sensor

Baker等[35]设计了一种电化学传感器，用于可卡因的检测。由图2可知，先将一段可卡因的核酸适体固定在金电极上，在核酸适体的另一段标记电活性基团MB。没有目标分子存在的情况下，MB是远离电极的；而可卡因存在下，该核酸适体与可卡因分子结合，因为G-四聚体等结构的形成导致空间结构变化，MB接触到电极表面，引起电信号的改变。根据MB的电化学信号的大小就可以得知可卡因的浓度。该方法灵敏度高，选择性好，有望发展成一种手提式的电化学检测装置。

2.2 适体在色谱检测中应用

由于高亲和力和特异性，免疫抗体是亲和色谱中应用最广的亲和配体，在分离纯化和检测分析中得到了广泛的应用。然而，在亲和色谱中，免疫抗体存在着一些明显的局限性：抗体固相化困难；体积大，固相表面覆盖率低；抗体易失活，受缓冲溶液影响大。与抗体相比，核酸适体具有很多优点，可以克服免疫抗体在亲和色谱中的局限性。这些优点主要表现在容易固定化、容易保持构象、固定相表面的覆盖率高、稳定性高、变性后容易复性等。相对于免疫抗体，适体在色谱检测方面应用的前景更加广阔。核酸适体亲和色谱充分发挥了适体与亲和色谱技术的优势，已经被应用于小分子、蛋白质和细胞的分离和检测。

Cruz-aguado等[36]筛选出可特异性识别赭曲霉素A(ochratoxin A)的DNA适体，构建了DNA适体亲和柱用于检测小麦样品中的赭曲霉素A。他们将赭曲霉素A的DNA适体共价键合在琼脂糖树脂上，然后填充在微柱中，制备了DNA适体亲和柱。该亲和柱能有选择性地将赭曲霉素A从含有甲醇的小麦样品的萃取液中富集，样品中的干扰物则被淋洗去除。被吸附的赭曲霉素A可以被含有20%甲醇的1mmol/L EDTA和10mmol/L Tris(pH9)的缓冲液有效地洗脱，通过荧光光谱检测洗脱得到赭曲霉素A，小麦样品中赭曲霉素A的含量为0.47μg/kg。

2.3 Aptazyme检测方法

近年美国Ellington等[4]在具有变构效应的核酶结构中插入适体序列重组构建成新的酶，称为aptazyme，其催化活性受适体的专一性配体控制，即当配体结合至适体区，aptazyme 酶活性增强[37-38]。aptazyme将适体和变构核酶(allosteric ribozyme)相结合，重组成为新的富有吸引力的分子开关，既具有适体的特异性识别能力又具有核酶催化活性，可以作为分子开关用于检测[39-40]。

aptazyme研究尚处于起步阶段，目前主要是对锤头型变构核酶和L1连接酶进行重组构建，已用于ATP、FMN、茶碱等分子的检测，检测灵敏度达到nmol/L级[39,41-42]。基于aptazyme检测的实验有很多优越性，但现有的aptazyme 实验大都以同位素作为示踪剂，通过检测放射活性推知靶分子含量。事实上，基于aptazyme方法同免疫测定法一样，也可通过不同报告分子(如酶、荧光素等)标记设计多种实验模式。

aptazyme作为适体检测应用的一种手段，可以借鉴上述研究应用到食品中抗生素的检测。相对于传感器、酶联检测，有一定的优势。但目前对于aptazyme的研究还处于初级阶段，aptazyme仍有许多不足之处尚待完善。

3 适体检测应用的前景

目前适体在检测抗生素等小分子方面的应用主要在传感器领域，而利用其代替抗体应用于酶联反应检测抗生素等小分子的技术少有报道。通过生物素-亲和素系统可以固定标记了生物素的适体或小分子，然后通过竞争法、酶反应信号的方法检测目标分子。生物素-亲和素系统的稳定性和适体同靶分子之间的高亲和力，以及酶标记信号放大作用，使得酶联适体方法具有理论上的可能性，并可以研制成为试剂盒，使用更为方便、快捷，相对传统的试剂盒，其成本低、灵敏度更高、特异性更强。因为识别分子适体性质稳定，变性后可以复性，使得酶联试剂盒的重复使用成为可能，有可能给检测试剂盒带来一场革命。

抗生素种类多，制备抗体困难，且食品、环境等含有的抗生素非常复杂，利用传统的酶联免疫方法检测，费时、费力、费财。如果针对复杂的抗生素分别筛选其适体则容易的多，因此在大样本筛查各种抗生素时，适体法更有潜力。相信在不久的将来，适体方法将取代传统抗体成为抗生素乃至其他小分子、大分子检测的重要手段。

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Advances in the Applications of Aptamers in Antibiotic Residue Detection

LIU Bin1，LIU Ying1，YI Zhi-zhong2，LAI Yi-dong2，PENG Xi-chun1，WU Xi-yang1,*
(1. Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China；2. Dongguan Supervision Testing Institute of Quality and Metrology, Dongguan 523120, China)

Q503

A

1002-6630(2010)17-0452-05

2009-12-22

国家自然科学基金面上项目(20677023)；东莞市高等院校科研机构科技计划项目(200910810176)

刘宾(1984—)，男，硕士研究生，研究方向为食品安全。E-mail：caisanrenju@163.com

*通信作者：吴希阳(1966—)，男，教授，博士，研究方向为食品安全、微生物。E-mail：tkentwu@jnu.edu.cn