李志才,易康乐

(湖南省畜牧兽医研究所,湖南 长沙 410131)

大理石花纹是指肌肉内脂肪数量和分布,与嫩度、多汁性和适口性有密切的关系[1]。我国2003年发布的《牛肉质量分级》行业标准中牛肉质量等级评定主要借鉴美国、日本的评定体系,以12～13脊肋处背最长肌横截面的大理石纹和牛的生理成熟度为主要评定指标牛肉。大理石花纹的丰富程度受多基因控制以及营养环境等因素影响[2,3]。

在美国、爱尔兰、西班牙、瑞典、英国等国大理石花纹是牛肉“货架质量”显著有用的指标。H-FABP是脂肪酸结合蛋白基因,主要在心脏和骨骼肌细胞、乳腺细胞表达,对肌间脂肪含量影响显著[2]。CAST是钙蛋白酶抑制蛋白,直接影响肌原纤维蛋白的代谢以及肌肉的嫩化[4]。MYOD1是生肌决定因子1基因,在肌肉生成过程中参与分子调节控制作用。MYOD1家族对生肌发生起重要调节作用,可激活静止状态的肌肉特有基因与肌肉特有的增强子结合共同促进转录,可促使成纤维细胞、成软骨细胞、平滑肌细胞等向骨骼肌细胞分化,对于家畜的肌肉生长有重要影响[5]。10%左右的肌内脂肪含量(intramuscular fat content,IMF)可产生理想的大理石花纹,从而形成优质高档牛肉[6]。因此可以利用对IMF含量进行遗传改良,以提高牛肉品质。

本实验旨在通过分析H-FABP基因5′端调控区的多态性和湘西黄牛肉肌内脂肪含量和大理石花纹丰富程度的相关性,利用最小二乘线性模型分析不同基因型与肉质性状中的肌内脂肪含量值和大理石花纹等级评分的关系,为湖南省地方品种-湘西黄牛的肉品质育种改良提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

23头实验牛来自湖南新晃县畜牧水产局肉牛育肥中心。屠宰时收集每一头牛的血样,每头 10 mL,共采集24份血样。血样用ACD抗凝,留做后续实验用。选取胴体第12～13肋骨间的眼肌横切面中背长肌为有效部位,以供大理石花纹等级和肌内脂肪含量评定。

1.2 实验方法

1.2.1 大理石花纹等级评定 以南京农业大学肉类研究室大理石花纹标准,采用人工肉眼判别大理石花纹等级。肌内脂肪含量由湖南农业大学食品检测中心测定。

1.2.2 脂肪测定方法 参照GB/T5009.6-2003标准进行。

1.2.3 血样基因组DNA的提取 采用上海捷瑞生物科技公司生产的全血基因组DNA提取试剂盒进行。得到的基因组DNA采用核酸蛋白测定仪测定其浓度,并用1%琼脂糖电泳检测。

1.2.4 引物设计与合成 根据已经发表的牛H-FABP基因序列扩增 H-FABP5′端调控区,长度为250 bp左右,设计引物如下:5'-TCT GTC GTC TT T CCC AAC CTA-3';5'-GGC TCC CCA ACC TTG AC-3'。

1.2.5 目的片段扩增 PCR扩增体系为 10×Buffer(Mg2+plus)2.0 μ L,20 μ mol/L 引 物 0.2 μ L,2.5 μ mol/L dNTPS1.6 μ L,5 U/μ LTaq 酶 0.4 μ L,模板 DNA 为 50 ng/L 的 1 μ L,加水至 20 μ L 。反应条件为:95℃预变性5 min,94℃变性40 s,58℃退火30 s,72℃延伸 40 s,72℃再延伸 8 min,共30个循环。

1.2.6 PCR-SSCP检测 本实验采用8%的丙烯酰胺胶,制胶,灌胶,点样,于室温下电泳(温度在8℃左右)2.5～3 h。电泳结束后用硝酸银染色,显色后,用去离子水漂洗2次,在凝胶成像系统中拍照保存。

1.2.7 纯合子序列测定 本实验选用PCR产物进行序列测定。选取特异性好的PCR扩增产物,利用百泰克回收试剂盒对其进行回收与纯化,纯化回收后送上海生工测定序列。测序结果经与NCBI登录号为DQ026674的序列进行比较,发现该群体中HFABP基因5′-调控区第136位发生了T碱基的插入,142位点发生了G※A转换。AA基因型为A142A纯合子,BB基因型为G142G纯合子。

1.3 数据统计分析

1.3.1 基因和基因型频率分析 基因型频率是指决定该性状的基因座上的两个等位基因或多个复等位基因所组成的各种基因型的个体分别在群体中所占的比率:基因频率是指同一基因座上两个等位基因或多个复等位基因分别在群体内该基因座上的基因总数中所占的比率。各基因的频率之和等于1。

其中,Pi:第i个等位基因的频率;i:纯合复等位基因;j1,j2,……,jn:与i共显的第1到第n个等位基因。

1.3.2 采用SPSS10.0统计软件分析H-FABP基因的遗传多态性与大理石花纹和肌内脂肪相关关系。

2 结果与分析

2.1 全血基因组DNA提取结果

图1 牛全血基因组DNA

图2 H-FABP基因PCR产物

图1中,左端为1 kb marker,右端为全血基因组DNA,从图中可以看出DNA条带清晰明亮,无拖尾现象,可以进行下一步实验。

2.2 目的片段扩增结果

图2所示,右端为100 bp DNAmarker,左端为PCR扩增产物,由图可见扩增产物长度为250 bp,与所预计的片段大小一致,且无非特异条带,可以进行下一步实验。

2.3 PCR-SSCP检测结果

从图3的结果中可以看出,本研究的样本中H-FABP基因存在2个等位基因(A、B),3个基因型AA(2)、BB(3,4)、AB(1,5,6)。实验用牛肉大理石纹等级、肌内脂肪含量、基因型之间的关系如表1。

图3 H-FABP基因扩增片段

表1 基因频率及基因型频率分布

从表1中可以看出:在这个群体中,等位基因A出现的频率为 0.48,等位基因 B出现的频率为0.52,基因型为AA出现的频率为0.24,AB型出现的频率为0.48,BB型出现的频率为0.28,基本符合孟德尔遗传规律。三个基因型之间的比率基本为:AA∶AB∶BB=1∶2∶1。

表2 湖南杂交牛H-FABP不同基因型与大理石花纹评分的方差分析

表3 湖南杂交牛H-FABP不同基因型与肌内脂肪含量的方差分析

从表2中可以看出:AA型(3.941)的大理石花纹评分值要极显著高于 AB型(2.131)和 BB型(1.983)(P<0.01),而AB型与BB型差异不显著(P>0.05);表3中可以看出:AA型(3.941)的肌内脂肪含量要极显著高于AB型(2.131)和BB型(1.983)(P<0.01),AB型要极显著高于BB型(P<0.01)。

H-FABP不同基因型对湘西黄牛大理石花纹和肌内脂肪含量的影响大体一致,呈现AA>AB>BB的趋势。

3 结论与讨论

湘西黄牛的 H-FABP基因与大理石花纹和肌肉脂肪存在着明显的相差性。

本研究检测到A、B两个等位基因和AA、AB、BB三种基因型,其中B等位基因为优势等位基因,大理石花纹评分值的最小二乘值在AA与AB、BB基因型之间差异显著(P<0.01),而AB、BB基因型之间差异不显著(P>0.05);AA型的肌内脂肪含量要极显著高于AB型和BB型(P<0.05),AB型要极显著高于BB型(P<0.05),说明该多态性位点对牛肉肌内脂肪含量影响极显著。H-FABP能够影响肌肉脂肪含量已经成为共识,Gerbens[7]等(1997)发现杜洛克猪的IMF与H-FABP基因显著相关,王彦[8]等(2007)对 7个品种的鸡研究显示H-FABP基因的两个位点基因型间IMF存在显著差异,文力正[9]等(2008)研究发现H-FABP对牛肉质嫩度有显著影响,而牛肉的大理石花纹与嫩度高度相关。根据肌内脂肪含量和大理石花纹等级相关标准发现,大理石花纹丰富程度较低,大理石花纹性状还有待提高,为了培育优质高档牛肉,今后可以通过遗传选育、加强环境管理、提高饲养条件等措施来提高大理石花纹等级。

本研究中样本有效含量有限,将在以后进行的类似检测工作中,扩大样本含量进行研究,进而减小误差。

[1] 刘木华,段武貌,黎 静,等.基于图象处理和支持向量机分类的牛肉大理石花纹等级评定[J].沈阳农业大学学报,2005,36(6):650-654.

[2] 仇雪梅,李 宁,吴常信,等.影响动物肉质性状主要候选基因的研究进展[J].遗传,2002,24(5):571-574.

[3] Kyu Ho Myang.调控牛肉大理石花纹的营养策略[J].Asian-Austra J Anisci,2004,(14):Special Issue:136-139.

[4] 曹 阳,张国梁,张立春,等.草原红牛CAST基因多态性与肉用性状的关联分析[J].第11次全国畜禽遗传标记研讨会论文集,248-251.

[5] 黄 萌,许尚忠,昝林森,等.牛 MyoD1基因遗传变异及其对胴体性状的影响[J].遗传繁育,2007,34(9):40-43.

[6] 邓桂馨.肉牛CAST基因和HFABPL基因多态性及其与肉品质性状关系的研究[D].北京:中国农业科学院,2003.

[7] Gerbens F,Rettenberger G,Lenstra J A,et al.Characterization,chromosomal localization,and genetic variation ofthe porcine heart fatty acid-binding protein[J].Mamm Genome,1997,8:328-332.

[8] 王 彦,朱 庆,舒鼎铭,等.鸡 H-FABP基因多态性及其与肌内脂肪含量的相关研究[J].中国畜牧杂志,2007,43(11):1-5.

[9] 文立正,赵玉民,张国梁,等.草原红牛 H-FABP基因单核苷酸多态性及其对肉质的影响[J].畜牧兽医科技,2008,24(5):17-21.