胡大强（第三军医大学第三附属医院药剂科，重庆市 400042）

蛋白转导结构域修饰小鼠干扰素-γ的研制

胡大强＊（第三军医大学第三附属医院药剂科，重庆市 400042）

目的：制备蛋白转导结构域修饰小鼠干扰素-γ（PTD-mIFN-γ），为研究PTD-mIFN-γ功能作准备。方法：以质粒pUC19/ mIFN-γ为模板，经3轮聚合酶链反应（PCR）扩增编码PTD-mIFN-γ片段，克隆于质粒pUC19上，测序鉴定正确后构建到pQE80L表达质粒载体中，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot法检测表达的目的蛋白，镍离子-次氨基三乙酸（Ni2＋-NTA）凝胶亲和层析纯化重组蛋白，酶联免疫吸附实验（ELISA）检测PTD-mIFN-γ。结果：PCR扩增得到编码PTD-mIFN-γ的cDNA，SDS-PAGE和Western blot法分析显示重组蛋白获得了高效表达，ELISA法检测出目的蛋白。结论：成功制备了PTD-mIFN-γ。

蛋白转导结构域；干扰素-γ；蛋白纯化；酶联免疫吸附实验

干扰素-γ（Interferon gamma，INF-γ）具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫等作用[1]，临床已广泛使用。临床上人IFN-γ主要用于类风湿性关节炎、抗肝纤维化治疗。大量研究[2]显示IFN-γ对防治寻常疣和皮肤瘢痕增生是有益的，但常规肌肉注射或者静脉给药可降低患者依从性，如果能制备成乳膏，直接外用可能将增加其应用范围。然而，因为IFN-γ的分子量超过1万，皮肤对其吸收有屏蔽作用，从而限制了IFN-γ在寻常疣、皮肤疤痕增生外用给药的应用。蛋白转导结构域（Protein transduction domain，PTD）强大的跨膜递送功能的发现为克服上述方法中的不足提供了可能。本文选择PTD作为人Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV-Ⅰ）的反式激活因子（TAT）的11肽[3]（氨基酸序列47～57，YGRKKRRQRRR），采用基因工程技术，将PTD连接于小鼠IFN-γ（mIFN-γ）N端，为进一步研究PTD-mIFN-γ跨皮肤递送等功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 质粒和菌株

测序质粒pUC19、pUC19/mIFNγ，表达质粒pQE80L和DH5α菌株，均由第三军医大学第三附属医院药理室保存。

1.2 试药与仪器

Tripure RNA提取试剂（美国Roche公司）；限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ、DNA聚合酶、T4连接酶（大连宝生物公司）；质粒提取试剂盒、DNA片段胶回收和聚合酶链反应（PCR）产物回收试剂盒（美国Omega公司）；引物由上海生工公司合成；抗His单抗和镍离子-次氨基三乙酸（Ni2+-NTA）层析系统（德国Qiagen公司）；异丙基硫代半乳糖苷（IPTG，美国Sigma公司）；小鼠IFN-γ酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒（晶美生物工程有限公司）。

1.3 引物的设计合成

设计扩增PTD-mIFN-γ引物，上、下游引物分别选用BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点，引物序列如下：

引物1：5′-TCTAAGCTTTCAGCAGCGACTCCTTTTCC-3′；引物2：5′-GAGACAGCGACGAAGACACGGCACAGTCATT-3′；引物3：5′-GAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA-3′；引物4：5′-GAGGATCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAG-3′。

1.4 PCR法扩增编码PTD-mIFN-γ cDNA片段

小量法提取测序正确的pUC19/mIFN-γ质粒作为第1轮PCR扩增模板，第2轮和第3轮PCR扩增模板分别为前一轮PCR产物；下游引物均为引物1分别与上游引物2～4组成3对引物，依次经3轮PCR扩增得到编码PTD-mIFN-γ片段。PCR反应条件为：94℃、5 min激活热启动TaqDNA聚合酶，然后94℃、30 s，63℃、30 s，72℃、1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物纯化后经BamHⅠ和HindⅢ内切酶酶切，回收目的片段构建到pUC19质粒，然后转化感受态DH5α细菌，蓝白斑筛选，挑选白斑单克隆接种培养后，小量法提取质粒，进行双酶切鉴定，对含阳性重组质粒细菌进行测序。

1.5 pQE80L/PTD-mIFN-γ表达载体的构建

将测序正确的pUC19/PTD-mIFN-γ质粒经小量法提取，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后琼脂糖电泳胶回收PTD-mIFN-γ片段，构建于pQE80L，转化感受态DH5α细菌，氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化单克隆接种培养后，小量法提取质粒，进行双酶切鉴定阳性克隆。

1.6 蛋白的诱导表达

挑取含重组原核表达载体的单个菌落接种于LB培养液中37℃、225 r·min－1振荡培养过夜，次日以1%接种到5 mL LB培养液中37℃振荡培养至吸光度（A600）为0.6时，加IPTG至终浓度为1 mmol·L－1，继续培养4 h，取上述培养液1 mL，10 000 r·min－1离心1 min，沉淀行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。取含重组原核表达载体的细菌50 mL，诱导表达蛋白，操作同“挑取”至“继续培养4 h”止，菌液离心后，弃去上清液，超声碎菌，功率为总功率的28%，工作时间2 s，间隔时间2 s，碎菌16 min。碎菌液10 000 r·min－1、4℃离心15 min，收集上清液和沉淀分别行SDS-PAGE。SDS-PAGE参照《现代分子生物学实验技术》[4]进行，使用15%的聚丙烯酰胺分离胶和5%浓缩胶，鉴定融合蛋白。

1.7 Western blot法

经诱导的pQE80L/PTD-mIFN-γ/DH5α及pQE80L/DH5α（阴性对照）工程菌行SDS-PAGE后，将凝胶上的蛋白经半干法电转移至硝酸纤维素膜，丽春红S染色后标出marker的位置，去离子水洗去膜上的丽春红S，5%脱脂奶粉室温封闭，加抗His单抗孵育，洗涤后加辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体室温孵育1 h，洗膜后加3，3-二氨基联苯胺（DAB）闭光显色。

1.8 Ni2+-NTA凝胶亲和层析柱纯化蛋白及蛋白含量测定

将含pQE80L/PTD-mIFN-γ质粒的表达菌株接种于500 mL LB培养中液中进行表达（方法同“1.6”项），离心收集诱导表达后的细菌，Lysis缓冲液（50 mmol·L－1NaH2PO4，300 mmol·L－1NaCl，10 mmol·L－1咪唑，NaOH调至pH 8.0）悬浮细菌，并加入溶菌酶置于冰上30 min后超声波破碎菌体，离心得到上清液。上清液过Ni2+-NTA凝胶层析柱，用Lysis缓冲液和Wash缓冲液（50 mmol·L－1NaH2PO4，300 mmol·L－1NaCl，20 mmol·L－1咪唑，NaOH调至pH 8.0）洗柱，直至吸光度A280小于0.01，Elution缓冲液（50 mmol·L－1NaH2PO4，300 mmol·L－1NaCl，250 mmol·L－1咪唑，NaOH调至pH 8.0）洗脱目的蛋白。行SDS-PAGE分析，透析纯化蛋白。纯化的蛋白冷冻干燥后－20℃保存。

冷冻干燥的PTD-mIFN-γ蛋白为白色疏松粉末，蛋白含量测定使用小鼠IFN-γ ELISA试剂盒，采用双抗夹心ELISA法测定。精密称取纯化蛋白用0.01mol·L－1磷酸盐缓冲液（PBS）溶解并稀释到15～2 000 pg·mL－1浓度范围内，mIFN-γ ELISA试剂盒测定，操作按试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 PCR扩增编码

3轮PCR扩增后得到的PTD-mIFN-γ片段，经1.2%琼脂糖凝胶电泳后显示在440 bp处有特异扩增条带，大小与理论值[5]一致，见图1。

图11.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PTD-mIFN-γ PCR产物Fig 1 Electrophoresis identification of PCR product of PTD-mIFN-γ in 1.2%agarose gel

测序结果为TATGGCAGGA AGAAGCGGAG ACAGCGACGA AGA CACGGCA CAGTCATTGA AAGCCTAGAA AGCCTGAATA ACTATTTTAA CTCAAGTGGC ATAGATGTGG AAGAAAAGAG TCTCTTCTTG GATATCTGGA GGAACTGGCA AAAGGATGGT GACATGAAAA TCCTGCAGAG CCAGATTATC TCTTTCTACC TCAGACTCTT TGAAGTCTTG AAAGACAATC AGGCCATCAG CAACAACATAAGCGTCATTG AATCACACCT GATTACTACC TTCTTCAGCA ACA GCAAGGC GAAAAAGGAT GCATTCATGA GTATTGCCAAGTTTGAGGTC AACAACCCAC AGGTCCAGCG CCAAGCATTC AATGAGCTCA TCCGAGTGGT CCACCAGCTG TTGCCGGAAT CCAGCCTCAG GAAGCGGAAA AGGAGTCGCT GCTGA，显示与理论值[5]一致。

2.2 pQE80L/PTD-mIFN-γ重组质粒构建

pQE80L/PTD-mIFN-γ经双酶切后琼脂糖凝胶电泳显示在440 bp和4.7 kb各有一条带，证明pQE80L/PTD-mIFN-γ成功构建，详见图2。

图2 pQE80L/PTD-mIFN-γ双酶切电泳图Fig 2 Electrophoresis of pQE80L/PTD-mIFN-γ double digested

2.3 重组蛋白的诱导表达

pQE80L/PTD-mIFN-γ质粒的DH5α菌，经IPTG诱导后表达了重组目的蛋白。SDS-PAGE结果显示，诱导表达的蛋白主要存在于上清液，说明PTD-mIFN-γ主要以可溶性形式存在于细菌中，详见图3。

2.4 Western blot法分析结果

经诱导的菌体裂解物与抗His单抗反应，在分子量约1.7×104Da处出现单一条带，而未经诱导的菌体则无此反应，说明所表达蛋白为PTD-mIFN-γ，详见图4。

2.5 蛋白的纯化与含量测定

图3 PTD-mIFN-γ蛋白表达SDS-PAGEFig 3 SDS-PAGE for expression of PTD-mIFN-γ protein

图4 重组蛋白的免疫印迹分析Fig 4 Western blot analysis of recombinant protein

表达蛋白经Ni2+-NTA凝胶纯化后行SDS-PAGE，结果电泳谱中呈单一条带，说明目的蛋白得到了纯较高程度纯化，mIFN-γ ELISA试剂盒检测出PTD-mIFN-γ的含量为39%。SDS-PAGE结果见图5。

图5 PTD-mIFN-γ的SDS-PAGE图Fig 5 SDS-PAGE of PTD-mIFN-γ

3 讨论

IFN-γ为Th细胞和自然杀伤（NK）细胞产生的细胞因子，具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等功能。临床上可用于类风湿性关节炎治疗和抗纤维化治疗，抗肿瘤及病毒治疗是其研究的新方向。PTD是蛋白转导过程中能高效穿过膜结构的多肽分子，除可介导蛋白分子、多肽等物质跨越皮肤递送外，还可高效穿过细胞膜进入到细胞内[6]以及跨越血脑屏障[7]进行物质递送。PTD与多肽或蛋白质以共价键结合，实现药物跨膜递送功能。PTD富含碱性精氨酸，α螺旋可使精氨酸残基构像优化从而增加转运效率[8]。

小鼠IFN-γ的N末端对蛋白的功能影响较大，PTD/TAT 11肽的位置不影响融合蛋白的功能，所以本文在编码mIFN-γ cDNA的5′端加上编码PTD的33个碱基，进而制备PTD-mIFN-γ，重组蛋白的表达菌株选择大肠杆菌DH5α，大肠杆菌中的细菌酶会特异分解mIFN-γ的C末端，如果PTD构建在mIFN-γ的C端，因融合蛋白的分离纯化采用亲和层析，标签His肽在蛋白的N端，制备的蛋白含有未连接PTD的野生干扰素，使目的蛋白不纯，进而影响其生物学活性。有关PTD/ TAT构建在mIFN-γ C端的实验工作已经完成，相关文章已发表[9]。本文采用PCR技术，通过3轮PCR扩增得到编码PTD-mIFN-γ cDNA片段，易于操作，方便可行。选择表达载体pQE80L可提高目的蛋白的表达量，并且表达的PTD-mIFN-γ为可溶性蛋白，能保持天然活性。由于表达蛋白N端含有6个His标签，可用Ni2+-NTA凝胶亲和层析柱纯化目的蛋白，操作简便可行。

[1]Smith O，Mayhew E，Reszka R，et al.Antiviral and antiproliferative properties of liposome-associated human interferon-γ[J].J Interferon Res，1990，10（2）：153.

[2]杨静，李惠.皮损内注射重组人干扰素γ治疗寻常疣[J].药学进展，2006，30（6）：280.

[3]Zhang XY，Dinh A，Cronin J，et al.Cellular uptake and lysosomal delivery of galactocerebrosidase tagged with the HIV Tat protein transduction domain[J].J Neurochem，2008，104（4）：1 055.

[4]卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].第2版.北京：中国协和医科大学出版社，1999：379～384.

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[6]Guelen L，Paterson H，Gaken J，et al.TAT apoptin is efficiently delivered and induces apoptosis in cancer cells[J].Oncogene，2004，23（5）：1 153.

[7]Popiel HA，Nagai Y，Fujikake N，et al.Protein transduction domain-mediated delivery of QBP1 suppresses polyglutamine-induced neurodegeneration in vivo[J].Mol Ther，2007，15（2）：303.

[8]Fan YF，Lu CZ，Xie J，et al.Apoptosis inhibition in ischemic brain by intraperitoneal PTD-BIR3-RING（XIAP）[J].Neurochemistry International，2006，48（1）：50.

[9]胡大强，何凤田，郑英如，等.TAT修饰的小鼠IFNγ的制备[J].第三军医大学学报，2006，28（8）：795.

Preparation of Protein Transduction Domain Modified Mice IFN-γ

HU Da-qiang（Dept.of Pharmacy，The Third Affiliated Hospital of The Third Military Medical University，Chongqing 400042，China）

OBJECTIVE：To prepare PTD modified mice interferon gamma（PTD-mIFN-γ）in order to prepare for its function research.METHODS：The code of PTD-mIFN-γ fragment was amplified by PCR for 3 times，using pUC19/mIFN-γ as template. The PCR product was cloned into pUC19 plasmid and then constructed into expression plasmid vector pQE80L after sequencing.After double digestion with BamHⅠand HindⅢ，the recombinant vector was identified in 1.2%agarose gel.The target protein and PTD-mIFN-γ was checked by SDS-PAGE，Western blot method and ELISA assay，respectively.Recombinant protein was purified by nikel ion-triglycollamic acid（Ni2＋-NTA）Agarose affinity chromatogram.RESULTS：The cDNA fragment encoding PTD-mIFN-γ amplified by PCR was obtained.The high-level expression of recombinant protein was noted in SDS-PAGE and Western blot assay.The target protein was obtained by ELISA assay.CONCLUSION：PTD-mIFN-γ was prepared successfully.

Protein transduction domain；IFN-γ；Protein purification；ELISA

R 965；R979.5

A

1001-0408（2010）01-0047-03

2009-02-18

2009-04-17）

＊主管药师，硕士。研究方向：抗肿瘤药物。电话：023-68898867。E-mail：dph.hdq@163.com