田晓艳, 刘延吉, 祝寰宇, 张弘, 刘沛含

(1.辽宁石油化工大学环境与生物工程学院,辽宁抚顺 113001;2.沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳 110161)

沙棘多糖HRPⅠa纯化及鉴定

田晓艳1, 刘延吉＊2, 祝寰宇2, 张弘1, 刘沛含1

(1.辽宁石油化工大学环境与生物工程学院,辽宁抚顺 113001;2.沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳 110161)

作者研究了沙棘多糖Ⅰ(Hippophae rhamnoidesL.polysaccharideⅠ,HRPⅠ)的组成。采用DEAE-SephadexA-50凝胶柱对粗提多糖进行分离,酶法对HRPⅠ脱蛋白后,Sephadex-G150层析对HRPⅠ多糖进一步提纯,HPLC层析确定HRPⅠa组成及组分比例,利用红外光谱鉴定多糖HRPⅠa糖苷键。采用DEAE-SephadexA-50凝胶柱分离多糖,得到2种组分分别为HRPⅠa、HRPⅠb。HPLC检测HRPⅠa水解物由木糖、甘露糖、葡萄糖组成,并且它们之间的摩尔比值为1∶1.06∶1.13。红外光谱确定多糖HRPⅠa构型同时含有α和β-型糖苷。

沙棘;多糖;纯化;鉴定

沙棘(Hippophae rhamnoidesL)为胡颓子科植物,沙棘果实中的活性成分已达到190多种,油中的活性成分有106种,其中脂溶性维生素有6种,脂肪酸22种,脂类42种,黄酮和酚类36种。沙棘黄酮具有抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗菌、抗病毒及增强免疫等广泛的功效。沙棘多糖(HRP)有较强的抗氧化作用,还对引起病毒性心肌炎的病毒具有明显的抑制作用。黄晓青等采用沙棘果榨汁提油后的果渣及籽渣提取的两种沙棘多糖为材料,通过沙棘多糖对小鼠实验性高脂血症的影响,观察其降血脂作用。证明沙棘多糖具有降低血清LDL-C,降低肝脏TC和高脂饮食引起的血糖升高,降低SGOT活性,保持肝脏功能。

目前对多糖生物学功效的研究愈来愈引起人们重视,成为当代生物学的热门领域。但目前尚无对沙棘多糖提取纯化的报道,作者对沙棘多糖HRPⅠa进行纯化和鉴定,为沙棘多糖开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

沙棘多糖由沈阳农业大学生物科学技术学院提供。

1.2 方法

1.2.1 沙棘多糖HRP的醇沉及部分理化性质测定 分别选取体积分数0～50%、50%～70%、70%～90%乙醇沉淀沙棘多糖,并对各沙棘多糖部分理化性质进行测定。

1.2.2 沙棘多糖HRPⅠ脱蛋白及透析 用木瓜蛋白酶法脱蛋白,并将脱蛋白质多糖装入活化好的透析袋中,流水透析48 h,蒸馏水透析72 h,不断换水,然后进行浓缩、醇沉、洗涤、真空干燥,得到半纯品多糖HRPⅠ。

1.2.3 粗多糖的分级纯化 将粗提得到的多糖HRPⅠ过DEAE-SephadexA-50凝胶柱,用去离子水及0.01～0.1 mol/L NaCl溶液梯度洗脱。

1.2.4 Sephadex-G150层析检验HRPⅠa多糖纯度 HRPⅠa高效液相色谱(HPLC)分析及HRPⅠa红外光谱检测。

2 结果与分析

2.1 沙棘多糖HRP的醇沉及其部分理化性质

体积分数0～50%乙醇沉淀得高相对分子质量多糖(HRPⅠ,88.5%);体积分数50%～70%乙醇沉淀得中等相对分子质量多糖(HRPⅡ,5.5%);体积分数70%～90%乙醇沉淀得相对分子质量较小的多糖及低聚糖(HRPⅢ,6.0%)。选取含量较高的HRPⅠ作为后续研究对象。由于HRPⅠ具有考马斯亮蓝G-250反应,说明HRPⅠ中含有蛋白质组分,故要对其脱蛋白质。

表1 HRP I、HRP II、HRP III部分理化性质Tab.1 Part of physicochemical property of HRP I、HRP II、HRP III

2.2 HRPⅠ脱蛋白

经过L9(34)正交实验,并用级差分析法来分析数据,得木瓜蛋白酶法脱蛋白质最佳条件:酶量5 mg/mL,酶解温度60℃,p H=6,且此条件下的蛋白质清除率为73.58%。

2.3 HRPⅠ分离——DEAE-SephadexA-50柱层析

沙棘多糖的DEAE-SephadexA-50凝胶柱层析洗脱曲线如图1。流速为0.5 mL/min,得两个单一对称洗脱峰,分别是1～20的水洗部分及0.05 mol/L NaCl洗脱部分;在0.01 mol/L NaCl及0.1 mol/L NaCl洗脱部分未见有多糖被检出。因此将以上水洗部分及0.05 mol/L NaCl洗脱部分分别收集,透析,冷冻干燥后得到乳白色絮状晶体及淡黄色絮状晶体,分别命名为亚组分HRPⅠa、HRPⅠb。通过苯酚-硫酸法检测,HRPIa、HRPIb的多糖得率分别为35.7%、8.5%,因此选择多糖得率较高的亚组分HRP I a做纯度检测及进一步研究。

图1 沙棘半精品多糖(HRPI)DEAE-SephadexA-50凝胶柱层析洗脱曲线Fig.1 Elution curve of HRPI on DEAE-SephadexA-50 column

2.4 HRPⅠa纯化——sephadexG-150柱层析

HRP Ia过Sephadex G-150柱,经苯酚硫酸法跟踪检测洗脱曲线为单一对称峰(见图2),由此说明HRPIa是相对分子质量分布均一的沙棘多糖亚组分。

图2 HRPIa的SephadexG-150凝胶柱层析洗脱曲线Fig.2 Elution curve of HRPIa on Sephadex G-150 column

图3和图4分别为标准单糖和HRPⅠa水解物的HPLC图谱。水解液出峰的保留时间分别与标准样中的木糖、甘露糖、葡萄糖相对应,说明AKSP2中含有这3种单糖,其摩尔量比值为1∶1.06∶1.13。

2.5 HRPⅠa红外光谱检测结果

多糖HRPⅠa在400～4 000 cm-1范围内的红外光谱,主要强吸收峰为2 933.8,1 383.9 cm-1处的两组峰。分别是糖类的伸缩振动及C—H变角振动,这两组峰是糖类物质重要的特征吸收峰。在1 746.1 cm-1处及1 622.1 cm-1处的吸收峰,系C=O伸缩振动引起的,说明HRPIa可能含有—COOH,—CHO等基团,且—CHO等基团具有还原性,这可能与多糖的抗氧化性有关。在1 327.4 cm-1处的吸收峰,系C=O对称伸缩振动引起的,说明HRP Ia中含有—COO结构;1 250～950 cm-1之间的几组峰,是吡喃糖环的醚键(C—O—C)和羟基的吸收峰;在916.3 cm-1处的吸收峰说明其含有β-D-半乳吡喃糖;在760 cm-1附近的吸收峰说明其含有α-D-木吡喃糖;在843～818 cm-1附近的吸收峰说明其含有α-D-甘露吡喃糖、β-D-甘露吡喃糖,以上几组峰说明HRP Ia既有α糖苷键又有β糖苷键。

图3 标准单糖高效液相图谱Fig.3 HPLC chromatograms of standard monosaccharides

图4 HRPⅠa水解物的高效液相图谱Fig.4 HPLC chromatograms of hydrolysates of HRPⅠa

3 结 语

采用DEAE-SephadexA-50凝胶柱对多糖分离,得到2种组分,即HRPⅠa、HRPⅠb。HPLC层析表明HRPⅠa由木糖、甘露糖、葡萄糖组成,且其摩尔比值为1∶1.06∶1.13。对多糖HRPⅠa在400～4 000 cm-1范围内的红外光谱分析表明,键型为α和β-型糖苷键。

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(责任编辑:朱明)

Purification,Identification of Polysaccharide HRPⅠa of Hippophae rhamnoidesL.

TIAN Xiao-yan1, LIU Yan-Ji＊2, ZHU Huan-Yu2, ZHAN G Hong1, LIU Pei-han1
(1.College of Environmental Technology and Biotechnology,Liaoning University of Petroleum&Chemical Technology, Fushun 113001,China;2.College of Biotechnology,Shenyang Agriculture University,Shenyang 110161,China)

The polysaccharide composition fromHippophae rhamnoidesL.polysaccharideⅠ(HRPⅠ)was study in this manuscript.Two different compositions,HRPⅠa,HRPⅠb were found in the isolated crude polysaccharide by DEAE-Sephadex-50 column the compositions of HRPⅠa contained xylose,mannose,glucose in 1∶1.06∶1.13 molar ratio.Furthermore,HRPⅠa configuration is composed ofαandβ-glycoside.

Hippophae rhamnoidesL.,polysaccharide,purification,identification

Q 539

:A

1673-1689(2010)01-0023-04

2009-01-09

国家863计划项目(2004AA247010)。

田晓艳(1971-),女,辽宁沈阳人,讲师,农学硕士,主要从事次生物质代谢研究。Email:maggietian2002@163.com

＊通讯作者:刘延吉(1959-),男,辽宁大连人,副教授,农学博士,主要从事细胞信号转导研究。Email:yanjiliu@yahoo.com.cn