张 禹,潘晓雯*,周 山,潘树义,胡慧军,高春锦,刘福佳

(1海军总医院,北京 100048;2首都医科大学附属北京朝阳医院)

神经生长因子(NGF)是重要的神经营养因子,对维持中枢系统神经元功能有重要作用[1]。在临床中应用高压氧(HBO)治疗颅脑损伤已得到广泛推广,并取得了较好疗效。2008年 11月 ～2009年3月,我们研究 HBO对脑损伤大鼠及健康大鼠脑内NGF表达的影响,同时探讨了单纯高气压环境对NGF表达的影响,比较其与 HBO的差异,为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康 Wistar大鼠 48只,体质量 230～270 g,由军事医学科学院实验动物中心提供。

1.2 主要仪器和试剂 DWC150-300型透明纯氧动物实验舱(上海 701所杨园医用氧舱厂制造);HPD-1700型液压撞击仪,TDS1002数字存储示波器(美国 DRAGONFLY研究与发展公司);微型磨钻(韩国生产);NGF兔抗多克隆抗体(武汉博士德生物技术有限公司);医用氧气及合成空气(北京普莱克斯实用气体有限公司)。

1.3 动物模型制备 应用液压撞击仪制作侧位液压冲击脑损伤大鼠模型。用 10%水合氯醛经腹腔注射麻醉(麻醉剂量为 0.3 ml/100 g),麻醉后将大鼠俯卧位固定于手术板上,无菌条件下切开左侧颅顶皮肤暴露颅骨,用微型磨钻于左顶骨钻孔,距离冠状缝 3 mm,矢状缝 2 mm,钻孔直径约 2 mm,保持硬脑膜完整。将液压撞击仪注满蒸馏水,调整冲击力度,使其在数字存储示波器上显示波峰为 1.5 V(0.3 MPa),该冲击压可使大鼠造成重度脑损伤。用塑料连接器连接撞击仪出水管与大鼠钻孔处,开动开关用蒸馏水冲击大鼠硬脑膜造成闭合性脑损伤,重复打击 3次。完成后骨蜡封闭钻孔缝合切口。

1.4 分组及处理方法 将 48只大鼠随机分成脑损伤组及正常对照组,每组 24只。脑损伤组均应用液压撞击仪制备脑损伤模型,再随机分成 3组,每组 8只。第 1组进行 HBO暴露:创伤 24 h后将大鼠置于动物实验舱内,纯氧洗舱 5 min,升压 5 min至0.25 MPa,稳压吸氧 45 min,减压 10 min。持续通风,氧流量维持在 1 L/min,舱内氧浓度维持在 95%以上。连续 5 d,1次/d。第 2组进行高压空气(HBA)暴露:创伤 24 h后将大鼠置于动物实验舱内,升压 5 min至 0.25 MPa,稳压 45 min,减压 10 min。持续通风,空气流量维持在 1 L/min。连续 5 d,1次/d。第 3组进行常压空气暴露:创伤后放置常温常压室内饲养,自由进食水,饲养时间与上述两组相同。正常对照组不进行模型制备,分 3组,每组8只,分别进行 HBO、HBA及常压空气暴露,具体暴露方法与脑损伤组相同。

1.5 NGF表达检测 所有动物在完成暴露后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,仰卧位固定于手术台上,开放腹腔,夹闭腹主动脉,打开胸腔,剪断肋骨,灌注针头插入心尖部,止血钳钳夹固定,依次以生理盐水 250 ml、4%多聚甲醛 PBS溶液 200 ml心脏灌注,可见大鼠双上肢及双眼球颜色转为苍白。断头取脑,取左侧大脑半球放入 4%多聚甲醛 PBS溶液固定。创伤组肉眼可见钻孔冲击处左顶叶凹陷性损伤,沿凹陷前后沿行冠状切开,正常对照组大鼠于同样平行位置冠状开,留取中间脑组织按常规脱水、媒染、浸蜡,最后将组织块包埋制成蜡块,石蜡切片机连续切片,厚度 5μm。行常规 HE染色及 NGF免疫组织化学染色。

1.6 结果分析 在 200倍光镜视野下,结合 HE染色切片,分别对各组切片的 NGF免疫组织化学染色阳性细胞进行计数,计数区域为大脑皮层区,计数 5个视野,最后取平均值,以个/视野来表示。

1.7 统计学方法 采用 SPSS 12.0软件进行统计分析,计数细胞用¯x±s表示,组间比较采用t检验,以 P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑损伤大鼠模型 在液压冲击的同时可见大鼠出现呼吸暂停,持续 3～5 s,四肢软瘫。缝合后 2～6 h陆续转醒,醒后可正常进食水,活动减少,未见肢体偏瘫等神经系统表现。断头取脑后肉眼可见部分脑创伤组大鼠脑表面沟回积血,符合蛛网膜下腔出血表现,局部硬膜下出血、脑实质出血及脑挫裂伤。

2.2 HE染色 光镜下,正常对照组大鼠神经元胞体呈圆形或椭圆形,形态正常,核膜完整,核仁清晰可见;脑损伤组各组损伤区域均可见神经元细胞胞体固缩、深染、拉长,或呈三角形,核膜不清,核仁不清,各组变性神经元数无明显差异。

2.3 免疫组织化学染色 光镜下 NGF免疫阳性细胞表现为神经元的胞膜、胞质、轴突及树突均可见的棕褐色阳性颗粒。两组 NGF免疫阳性细胞数见表 1。

表 1 两组 NGF免疫阳性细胞数(¯x±s)

3 讨论

NGF在脑损伤后可以促进神经细胞的修复,同时促进轴突生长以促进神经元环路的重建[2,3]。由于神经细胞的迁移是脑损伤后神经干细胞参与脑修复的重要过程,我们认为 NGF对脑损伤后神经干细胞的迁移也产生重要的作用[4]。由于外源性 NGF不易透过血脑屏障,所以促进内源性 NGF的分泌,提高内源性 NGF的表达是脑损伤后促进神经细胞修复的重要手段。

国内外广泛应用 HBO治疗颅脑损伤,取得了显著的临床疗效,其可促醒、减少外伤后并发症、促进神经功能恢复。HBO治疗的目的是阻断脑缺血—脑水肿—颅内高压的恶性循环。已经明确的 HBO机制包括:①HBO可以使大脑中动脉系统收缩,血流量减少,血氧含量增加,能在脑血流量减少的情况下改善供氧,降低颅内压,减轻脑水肿。②抑制炎症反应和自由基的作用。常规 HBO治疗可减少体内自由基,降低血清脂质过氧化物含量,从而对缺血缺氧的神经元起到保护作用。③HBO能使钙泵功能恢复减轻钙超载,脑水肿减轻,减少 TXA2产生。

本研究发现,脑损伤 HBO暴露组 NGF免疫阳性细胞数量多于脑损伤 HBA及常压空气暴露组,故可以肯定是 HBO对 NGF的高水平表达起到了一定的作用,而非 HBA所致;HBO对正常脑组织 NGF的表达无增强作用,但是对损伤后脑组织的 NGF表达有明显增强作用,从而促进神经细胞的恢复[5]。有研究发现[6],脑损伤后可以诱导 c-fos基因的表达,并在继发性反应中具有重要的调节作用,后者通过构成 AP-1转录因子,对其下游基因的表达进行调控,其中 NGF就是一个非常重要的靶基因。HBO是否通过某些机制参与到上述调控过程,从而促进NGF的表达,有待进一步研究。

[1]Mitchell JJ,Paiva M,Walker DW,et al.BDNFand NGF afford in vitro neuroprotection against ethanol combined with acute ischemia and chronic hypoglycemia[J].Dev Neurosci,1999,21(1):68-75.

[2]Xiong Y,Peterson PL,Lee CP.Alterations in cerebral energy metabolism induced by traumatic brain injury[J].Neurol Res,2001,23(2-3):129-138.

[3]王永堂,鲁秀敏.神经营养因子及其在周围神经损伤修复中的作用机制[J].人民军医,2006,49(6):359-361.

[4]施英唐,马骥,袁崇刚.神经生长因子诱导神经干细胞定向迁移[J].解剖学报,2004,35(1):22-25.

[5]李媛,邵金贵.神经生长因子与脑的研究进展[J].医学综述,2008,14(22):3394-3396.

[6]吉健勇,周晓平.颅脑损伤与中枢神经元基因表达改变研究进展[J].国外医学:神经病学神经外科学分册,1998,25(5):231-233.