张希廉,田军彪

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年SD雌性大鼠(许可证号:SCXK冀2003-1-003)60只,体重(200±20)g,由河北医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要实验仪器 SR-6N型大鼠脑立体定位仪(日本),BP211D型微量天平(中国),LDZ5-2型低速自动平衡离心机(中国),5 μ L微量进样器(上海),OLYMPUS CH2O型显微镜(德国),Leica RM2245型石蜡切片机(德国),图像分析系统(美国)。

1.3 主要药物和试剂 美多巴:瑞士巴塞尔豪夫迈罗氏有限公司;6-OHDA、阿扑吗啡(APO):Sigma公司;中药抗颤宁8剂:河北医科大学中医院制剂室制备;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、NO测试盒:南京建成生物工程研究所;一抗T H抗体(1∶100):美国SANTA CRUZ 公司;二抗IgG(1∶200):河北博海生物工程有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 中药煎取 龟板15 g,白芍20 g,黄芪15 g,当归12 g,鸡血藤15 g,天麻15 g,川朴15 g,云苓 12 g,川芎 6 g,炙甘草9 g,水煎2次,将两煎液混合浓缩成每 1 mL含生药3.35 g的水煎液,分装,密封,冷藏保存。

1.4.2 动物分组 全部大鼠均进行行为检测,确认无震颤、运动减少、肢体僵硬、竖毛、竖尾等行为后,每笼5只喂养(室温 22℃,湿度45%)。1周后随机选出8只作为假手术组;其余造模,造模成功大鼠根据随机数字表随机分成模型组、中药组、西药组各8只。

1.4.3 模型制备 取SD大鼠,用10%水合氯醛给予大鼠腹腔注射麻醉后,固定于脑立体定位仪上,剪去头部头发,在常规消毒下,于头颅正中切开头皮和皮下组织,确定前囟坐标,参照文献[1]大鼠脑立体定位图谱,确定右侧黑质两坐标为:①前囟尾侧4.4 mm,矢状缝右侧1.2 mm,硬膜下7.8 mm;②前囟尾侧4.8 mm,矢状缝右侧1.0 mm,硬膜下7.8 mm。计算出注射点的相对坐标,进行标记定位后,牙科钻在相应部位钻透颅骨,勿损伤硬脑膜。用5 μ L微量进样器吸取6-OHDA 4μL(浓度为4 μ g/μL),每孔 2 μ L,缓 慢进针至预定深度,以 1 μ L/min 的速度注入,注射完毕后留针10 min,以1 mm/min的速度缓慢退出,缝合皮肤。术后前3 d腹腔注射青霉素钠2×105U,以预防感染。

1.4.4 行为学检测 术后第14天进行行为学检测,给受试大鼠腹腔注射APO 0.5 mg/kg,以诱发大鼠向左侧单向旋转,并记录旋转开始时间、结束时间和旋转圈数。若大鼠恒定转向左侧(圈数不限),视为模型制作成功大鼠。

1.4.5 给药方法 中药组大鼠灌服抗颤宁方,西药组大鼠灌服美多巴,用药量分别为:33.5 g/kg、125 mg/kg,分别相当于按人和动物每千克体重剂量的15倍、30倍[2];模型组大鼠给予等体积的蒸馏水。于术后第15天给药,每日剂量于16:00～17:00 1次灌胃,均灌胃 14 d。

1.4.6 测定抗氧化酶及脂质过氧化改变 末次灌胃后次日将大鼠用10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉后打开腹腔,充分暴露心脏,用5 mL注射器针头刺进左心室,取不抗凝全血3 mL,静置20min后用低速离心机3000r/min离心15min后取血清,-37℃冰箱保存,以比色法分别测定血清中SOD的活性、MDA含量及NO含量。

1.4.7 酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色 取血后依次经左心室从升主动脉灌注约200 mL生理盐水,同时剪开右心耳,随后再灌注4%多聚甲醛作内固定,而后断头取脑浸泡于4%多聚甲醛溶液中放4℃冰箱固定24 h,然后用PBS漂洗30 min,每分钟3次,梯度酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋。作石蜡连续冠状切片,片厚 5μ m,切片直接贴覆于明胶包被的载玻片上,每块组织间隔选取4张切片,将切片脱蜡,用0.01 mol/L PBS冲洗后,用0.1 mol/L磷酸缓冲液配制的4%多聚甲醛室温固定30 min,然后按SABC法作TH免疫组织化学染色,200倍相差显微镜下随机取5个4 mm2的视野,用图像分析系统分别累计右侧黑质的TH阳性神经元数目并计算其均数。

1.5 统计学处理 采用SAS统计软件对数据进行t检验或完全随机的单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠治疗后SOD、MDA和NO变化(见表1) 模型组与西药组大鼠SOD活性均较假手术组明显下降(P＜0.01),中药组大鼠SOD活性与假手术组比较无统计学意义(P＞0.05);模型组大鼠 MDA、NO含量与假手术组、中药组、西药组比较均明显升高(P＜0.05),而中药组与西药组大鼠MDA、NO含量与假手术组比较无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠给药后SOD、M DA和NO变化(±s)

表1 各组大鼠给药后SOD、M DA和NO变化(±s)

组别 SOD(U/mL) M DA(μ mol/L) NO(μ mol/L)假手术组 148.592±17.000 22.725±7.005 25.778±14.389模型组 108.298±16.0302) 33.151±7.7091) 79.776±22.0761)西药组 118.612±15.4322) 22.377±3.1903) 49.778±25.2343)中药组 144.620±6.4014) 22.275±2.3413) 32.446±15.0603)与假手术组比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01;与模型组比较,3)P＜0.05;与西药组比较,4)P＜0.05

2.2 各组大鼠右侧黑质的T H阳性细胞计数(见表2) 假手术组、中药组、西药组大鼠右侧黑质的TH阳性细胞计数均多于模型组(P＜0.01);中药组大鼠右侧黑质的T H阳性细胞计数亦多于西药组(P＜0.05);假手术组大鼠右侧黑质的TH阳性细胞计数多于西药组(P＜0.01);中药组大鼠右侧黑质的TH阳性细胞计数与假手术组无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各组大鼠右侧黑质T H阳性细胞计数(±s)

表2 各组大鼠右侧黑质T H阳性细胞计数(±s)

组别 视野 右侧黑质假手术组 20 42.000±15.3791)模型组 20 5.160±6.598中药组 20 33.200±11.3891)西药组 20 17.600±4.3931)3)与模型组比较,1)P＜0.01;中药组与西药组比较,2)P＜0.05;西药组与假手术组比较,3)P＜0.01

2.3 各组右侧黑质的TH阳性细胞结果 在假手术组右侧黑质可见密集的TH阳性细胞,呈棕褐色,这些细胞体主要为圆形或卵圆形,少数为多边形,有些细胞分枝状树突、单根或成束的轴突清晰可见[3]。而模型组右侧黑质可见少量、稀疏的TH阳性细胞,呈棕褐色,细胞计数为假手术组右侧黑质的12.29%(5.16/42);而中药组黑质可见较密集的TH阳性细胞,呈棕褐色,细胞体亦主要为圆形或卵圆形,少数为多边形,细胞计数为假手术组右侧黑质的79.05%(33.2/42);西药组亦可见密集的T H阳性细胞,呈棕褐色,细胞体亦主要为圆形或卵圆形,少数为多边形,细胞计数为假手术组右侧黑质的41.91%(17.6/42)。

3 讨 论

3.1 脂质过氧化 现代研究认为,6-OHDA通过和多巴胺竞争,可与高亲和力的多巴胺转运体结合进入黑质纹状体多巴胺能神经元,并迅速被分子氧氧化形成 H2O2、超氧化物和醌,生成的大量活性氧自由基和氢氧自由基[4]超出了多巴胺能神经元自身抗氧化清除自由基的能力,使生物膜中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,产生一系列的脂质过氧化物,其中MDA毒性最强,发挥神经毒性作用,导致黑质纹状体多巴胺能神经元死亡。另外,6-OHDA还有抑制线粒体呼吸链的功能,诱发细胞凋亡等方面机制而发挥神经毒性作用。本实验结果表明:抗颤宁方在增加SOD的活性方面优于美多巴,而在减低MDA含量方面与美多巴无差别;SOD活性的降低使得自由基的产生过多,自由基的增加使得不饱和脂肪酸水平降低,其代谢产物MDA在体内增加,这是基于脂质过氧化反应增强的结果。有研究表明[5]:在PD的早期,黑质纹状体多巴胺能神经元中的SOD活性增强,这是自由基产生增多时机体的一种代偿性反应;随着病情的加重,氧化和抗氧化的平衡关系被打破,导致细胞的受损和死亡。

3.2 NO的神经毒性作用 NO是一种具有自由基性质的生物活性分子,在体内有生物信使作用,但过量的NO还表现出神经毒性[6]。NO和过氧化物反应产生的过亚硝酸盐能降低黑质纹状体通路中细胞的抗氧化能力,导致多巴胺能神经元死亡;另外,NO还会引起许多蛋白的亚硝基化,抑制磷酸化和糖酵解通路;也可通过损害DNA导致二磷酸腺苷核糖多聚酶过度活化引起神经细胞三磷酸腺苷衰竭和死亡发挥神经毒性作用[7]。本实验结果表明抗颤宁方可降低血清中NO的含量。

3.3 T H免疫组织化学 由于黑质致密部呈斜扁柱状,体积狭小,在冠状面上最长垂直距离不足0.5 mm。TH作为DA能神经元的标志物具有特异性[8],故TH免疫组织化学方法常被用于显示DA能神经元细胞体及其突起。本研究应用TH免疫组织化学方法清晰地显示了神经元细胞体及突起。实验结果表明中药和西药均能保护多巴胺能神经元免受损害,但中药疗效优于西药。

3.4 帕金森病的中西医治疗概况 帕金森病(PD)是临床上较为常见的神经系统退行性疾病之一,具有特征性的临床表现和病理学特点。目前对于帕金森病的治疗常采用多巴胺类制剂,但这些药物不能阻止病情的进展,且随着病情发展,用药量会逐渐增大,许多病人会出现严重的并发症及副反应,而且病情晚期会出现种种非多巴胺能的非运动障碍症状,现有的多巴胺能或非多巴胺能药物几乎对这些症状无效。手术治疗亦有其局限性,细胞移植及基因治疗有望治愈帕金森病,但仍处于试验研究阶段[9]。

祖国医学治疗帕金森病具有独特的特点和优点,中医药从整体辩证着眼,标本兼治,通过调节机体整体状况,提高生存质量而起作用;与西医药相比,中医药具有适应性广、不良反应小、远期疗效较好且不易产生耐受性等优点;另外,很多研究者对服用美多巴产生的运动波动症进行观察发现,中药可减少剂末少动及开关现象的发生,并可延长开期时间[10]。但是诸家对帕金森病的辨证和治疗存在分歧,说明中医、中西医结合对帕金森病的认识尚处于较浅的层面;另外,目前国际上已有大量文献探讨帕金森病的非运动障碍症状的问题;中医文献中还很少有关中药治疗帕金森病非运动症状的报道。帕金森病病因繁多,病机复杂。古代医家对此病多从肝、从肾、从风方面治疗。现代医家对本病的治疗用药也进行了大量的研究[11,12]。

通过长期临床观察认为帕金森病主要病变部位在脑,主要病机是由于肝肾阴虚,虚风内动,损伤脑络,神机受损,筋脉肢体失控,加之久病入络,耗气伤血,致气血亏虚,筋脉失养,而发肢体震颤、肌肉僵直、运动迟缓。创制了滋补肝肾、益气养血、熄风止颤中药抗颤宁方;方中龟板、天麻为君药,黄芪、当归为臣药,白芍、鸡血藤、川芎、川朴、云苓为佐药,炙甘草为佐使药。帕金森病早期可单独应用中医药,推迟多巴胺类制剂的使用时间;帕金森中晚期使用多巴胺类制剂且同时应用中医药,可减少多巴胺类制剂的用量,减轻西药的不良反应,从而延长多巴胺类制剂的使用时间,并可在一定程度上解决西药的不良反应及对药物的耐受性而不能坚持服药的问题。本实验结果[13]表明抗颤宁方治疗帕金森病的可能机制在于:一是改善整体和局部脑组织的氧化应激状态,减少自由基对多巴胺能神经元的氧化损害;二是可能通过抑制NO的神经毒性起作用;三是可能通过保护DA能神经元免受损害而相对增加其数量起作用。

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[2] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,2006:31.

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[5] 王红梅,罗德欣,王志平,等.帕金森病与自由基的生成和氧化的关系[J].中国临床康复,2002,6(3):373.

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[12] 何建成.帕金森病中医药治疗的再思考-兼谈“滋肾平肝,化痰活血,解毒散结”是帕金森病的基本治疗法则[J].中医药通报,2005,4(1):12-14.

[13] 张希廉,田军彪.抗颤宁方对帕金森病大鼠行为学及脂质过氧化的影响[J].河北中医杂志,2009,31(3):441-443.