楼丹飞,曹 敏,王佑华,周 端

冠心病是动脉粥样硬化病变使冠状动脉狭窄、闭塞,影响冠状循环血流,引起心肌缺血的一种心脏病。冠心病的发病率已跃居心脏病首位,严重危害人们的身心健康,防治冠心病已成为各国不容忽视的严峻课题。上海中医药大学附属龙华医院周端教授临床采用益气活血通痹法治疗冠心病心绞痛收到较好效果,此后根据益气活血通痹法自拟了小复方(生晒参、三七、麝香),并在前期实验研究中观察益气活血通痹小复方不同粒径制剂的体外溶出度情况[1,2]。本文在前期研究基础上,观察了益气活血通痹小复方对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响,以进一步探讨该方作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级 SD大鼠,体重200 g～250 g,共63只,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证号:SCXK(沪)2003～ 0003。

1.1.2 实验药物 益气活血通痹小复方:由生晒参(上海万仕诚国药制品有限公司,吉林,批号:070115)1.5 g,三七(上海万仕诚国药制品有限公司,云南,批号:070104)1.5 g,麝香(中国阿坝洲医药公司总经销,四川,批号:20070628)0.1 g组成,由上海超微科技有限公司用超微6 L粉碎机粉碎成粗粉(24目～65目/250 μ m ～ 850 μ m)、中粉(65 目 ～ 100 目/150 μ m ～ 250 μ m),超微细粉(625目/20 μ m)。粗粉组、中粉组、超微细粉组,双蒸水溶解,制备成每毫升含 37.7 mg/mL的药液。煎剂组,每毫升含生药量37.7 mg/mL。麝香保心丸(上海和黄药业有限公司,上海,批号:A070402)研磨成粉,双蒸水溶解,制备成每毫升含1.65 mg/mL麝香保心丸的药液。

1.1.3 主要仪器 小动物呼吸机ALC-V8(上海奥尔柯特生物技术有限公司);Powerlab8/30生理记录仪(AD Instrument,澳大利亚);T P1020型组织自动脱水机,EG1160型全自动石蜡包埋机,RM2235切片机,Histobath型HI1210展摊片机,HistoplateHI1220型烘片机(EICA,德国);DHG-9140A电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂);MV-CP410型摄像机(Panasonic,日本);CX31型显微镜,BH2型荧光倒置显微镜(Olympus,日本)。

1.1.4 主要试剂 Krebs-Henseleit(K-H)缓冲液:其组成成分为:NaCl 118.0 mmol/L,KCl 4.7 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,M gSO4◦7H2O 1.2 mmol/L,NaHCO325.0 mmol/L,Glucose 11.0 mmol/L,以双蒸水溶解,最后加入 CaCl22.5 mmol/L。溶液以95%O2+5%CO2的混合气体预充20 min以上,灌流液pH 7.35～7.45。

1.2 分组与给药 共分7组,每组大鼠9只。假手术组、模型组予生理盐水2 mL/d灌胃;粗粉组予粗粉136.8 mg/(kg◦d);中粉组予中粉136.8 mg/(kg◦d);超微细粉组予超微细粉136.8 mg/(kg◦d);煎剂组予煎剂136.8mg/(kg◦d);麝香保心丸组予麝香保心丸12.3 mg/(kg◦d)。每天灌胃,连续14 d。

1.3 造模方法 最后1 d灌胃30 min后,除假手术组外各组均行冠脉结扎。方法参考文献[3,4]稍作改动,具体步骤:用3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)行腹腔注射麻醉大鼠,麻醉满意后固定于鼠板上,用18号静脉留置针行气管插管,连接动物呼吸机行人工呼吸(呼吸比为 1∶2,潮气量20 mL/min～22 mL/min)。四肢皮下连接心电图电极,记录Ⅱ导联心电图。胸骨左侧剃毛,于剑突上1.0 cm,旁开约0.5 cm切开皮肤,逐层钝性分离皮下组织、肌肉,剪断第三根肋骨,用开睑器撑开胸腔,剥离心包膜暴露心脏,在动脉圆锥和左心耳之间,左心耳下方约1 mm～2 mm,用0/5号带线缝合针,进针深度控制在0.1 cm左右,宽度为0.1 cm～0.2 cm之间结扎冠状动脉左前降支,结扎处放一长约0.5 cm、直径为1.5 mm软棉线,用丝线活结结扎。结扎后迅速清除胸腔内多余血液,观察心电图变化,以心电图J点明显抬高(＞0.1 mV)并稳定10 min以上,心尖部心肌呈灰白色为模型制备成功标志。假手术组用同样大小的带线缝合针从左心耳下缘右侧进针,从肺动脉圆锥左侧出针,进针深度及宽度同上,但缝合针不打结。其余操作同上。各组冠状动脉结扎60 min后,腹主动脉取血,迅速开胸取出心脏,置入4℃含95%O2、5%CO2饱和K-H液中,轻轻挤压心脏排出心脏内残血,修剪出主动脉端口,将离体心脏固定到 Langendorff装置上,恒温(37℃),恒压(80 cmH2O柱)K-H液灌流,持续通入 95%O2～5%CO2气体。用钩针挑松结扎丝线,再灌注120 min。从左心耳插入带球囊的导管至左心室,经压力换能器连接到Powerlab生理记录仪上。将灌流完毕的心脏取下,用滤纸吸去心脏多余的灌流液,剪去心房、结缔组织、大血管和心包组织,沿室间隔分离左心室(包括室间隔)和右心室,弃右心室,左心室以冰生理盐水冲洗干净,部分置中性甲醛溶液中固定,剩余部分立即保存在-70℃冰箱中。

1.4 主要观测指标及测定方法

1.4.1 血流动力学 将带有球囊的导管从左心耳插入至左心室,经压力换能器连接到Powerlab生理记录仪上连续记录左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左心室内压最大上升/下降速率(±dp/dtmax)等血流动力学指标。

1.4.2 冠脉流量(coronary flow,CF) 收集平衡后10 min、30 min、60 min、90 min、120 min 五个时间点 1 min内的冠脉漏出液,使用量筒测量各组1 min内冠脉流量。

1.4.3 心肌HE染色 大鼠在心脏灌流120 min后,摘取心脏,取结扎点以下5 mm处心肌组织周径容积,中性甲醛溶液固定心脏,按常规石蜡包埋后,每个组织块做切片(厚度4 μ m),行苏木素-伊红(HE)染色。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。数据用均数±标准差(±s)表示。符合正态分布的多组样本间比较采用oneway ANOVA检验;不符合正态分布的均数比较用非参数检验。P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组血流动力学变化

2.1.1 左室收缩压 在各时间段,模型组与假手术组比较LVSP降低明显(P＜0.01)。与模型组同时间点相比,各治疗组均能改善LVSP的降低(P＜0.05或 P＜0.01)。灌流 30 min、90min、120min时,中粉组、超微细粉组优于麝香保心丸组(P＜0.05);灌流10min时,超微细粉组优于麝香保心丸组(P＜0.05)。在各时间点,超微细粉组优于粗粉组(P＜0.05),在灌流90min时,中粉组优于粗粉组(P＜0.05)。与煎剂组相比较,灌流30 min时,中粉组优于煎剂组(P＜0.05);灌流10 min、30 min、120 min时,超微细粉组优于煎剂组(P＜0.05)。中粉组和超微细粉组比较无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

表1 各组左室收缩压的变化(±s)mmHg

表1 各组左室收缩压的变化(±s)mmHg

组别 n 10 min 30 min 60 min 90 min 120 min假手术组 9 85.98±15.18 79.80±15.91 73.56±14.02 71.80±15.06 74.37±15.92模型组 8 42.04±16.081) 42.77±13.491) 41.87±15.541) 43.52±16.901) 43.91±14.891)粗粉组 7 52.37±21.311)2) 54.66±14.311)2) 51.97±17.061)2) 51.62±20.661)2) 52.23±18.801)2)中粉组 8 59.84±18.351)3) 61.71±18.861)3)4)6) 59.15±20.471)3) 59.53±20.551)3)4)5) 57.75±19.111)3)4)超微细粉组 8 61.74±13.401)3)4)5)6) 62.71±15.511)3)4)5)6) 60.08±11.481)3)5) 59.39±11.111)3)4)5) 59.04±10.951)3)4)5)6)煎剂组 8 53.03±22.221)3) 51.69±16.621)2) 54.71±15.991)3) 54.14±18.821)3) 51.54±17.331)2)麝香保心丸组 7 58.88±22.321)2) 52.92±12.411)2) 57.03±9.341)3) 56.37±13.481)2) 49.33±13.131)2)与假手术组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.05,3)P＜0.01;与麝香保心丸组比较,4)P＜0.05;与粗粉组比较,5)P＜0.05;与煎剂组比较,6)P＜0.05

2.1.2 左室舒张末压 与假手术组比较,在各时间点,模型组LVEDP升高明显(P＜0.01)。与模型组相比,在各时间点,中粉组、超微细粉组、麝香保心丸组能改善LVEDP的抬高(P＜0.05或 P＜0.01);灌流 90 min、120 min时,粗粉组优于模型组(P＜0.05或 P＜0.01)。与粗粉组相比较,在灌流 10 min时,中粉组、超微细粉组优于粗粉组(P＜0.01);在灌流30 min时,超微细粉组优于粗粉组(P＜0.05)。与煎剂组比较,在各时间点,中粉组、超微细粉组优于煎剂组(P＜0.05或 P＜0.01);在灌流120 min时,粗粉组、麝香保心丸组优于煎剂组(P＜0.01)。中粉组和超微细粉组比较无统计学意义(P＞0.05)。详见表2。

表2 各组左室舒张末压的变化(±s) mmHg

表2 各组左室舒张末压的变化(±s) mmHg

组别 n 10 min 30 min 60 min 90 min 120 min假手术组 9 3.93±2.87 3.90±2.99 6.06±3.59 6.31±3.81 6.45±3.41模型组 8 9.78±2.612) 10.28±2.782) 11.56±3.642) 12.80±4.012) 12.21±3.982)粗粉组 7 9.92±5.272) 8.75±4.042) 9.72±4.891) 9.11±4.673) 7.59±4.354)8)中粉组 8 6.17±4.354)6)8) 6.64±4.271)4)7) 6.90±4.764)8) 7.07±5.214)7) 7.43±4.634)8)超微细粉组 8 5.74±3.354)6)8) 5.49±4.054)5)7) 7.27±6.214)8) 7.15±6.144)7) 6.08±6.384)8)煎剂组 8 9.60±2.981) 10.10±3.062) 11.40±3.682) 11.12±3.402) 11.25±3.092)麝香保心丸组 7 6.66±2.551)3) 7.04±3.102)4) 7.85±3.273) 8.97±5.343) 6.78±4.012)4)8)与假手术组比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01;与模型组比较,3)P＜0.05,4)P＜0.01;与粗粉组比较,5)P＜0.05,6)P＜0.01;与煎剂组比较,7)P＜0.05,8)P＜0.01

2.1.3 左心室内压最大上升速率 在各时间段,与假手术组比较,模型组+dp/dtmax下降明显(P＜0.01)。与模型组比较,麝香保心丸组、益气活血通痹小复方各组在各时间点均能显著改善+dp/dtmax的变化(P＜0.01),但两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。在灌注30 min时,超微细粉组优于煎剂组(P＜0.01)。详见表3。

表3 各组左心室内压最大上升速率的变化(±s)

表3 各组左心室内压最大上升速率的变化(±s)

组别 n 10 min 30 min 60 min 90 min 120 min假手术组 9 2 396±457 2 291±410 2084±362 2 012±376 1 991±375模型组 8 1 136±3581) 1 164±3421) 1 159±4331) 1 163±4301) 1 145±4311)粗粉组 7 1 579±4061)2) 1 643±2991)2) 1 684±2011)2) 1 619±2991)2) 1 627±3141)2)中粉组 8 1 666±3731)2) 1 813±2631)2) 1 678±3711)2) 1 644±2201)2) 1 730±2091)2)超微细粉组 8 1 791±4811)2) 1 797±4261)2)3) 1 630±2781)2) 1 615±3001)2) 1 586±2811)2)煎剂组 8 1 565±4801)2) 1 895±3701)2) 1 733±4511)2) 1 670±4991)2) 1 697±4241)2)麝香保心丸组 7 1 660±4711)2) 1 759±4541)2) 1 554±4041)2) 1 574±4051)2) 1 556±4051)2)与假手术组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.01;与煎剂组比较,3)P＜0.01

2.1.4 左心室内压最大下降速率 在各时间点,与假手术组比较,模型组-dp/dtmax下降明显(P＜0.01)。与模型组比较,在灌流30 min时,中粉组、超微细粉组、煎剂组、麝香保心丸组对此有一定的改善作用(P＜0.05或P＜0.01);在灌流60 min时,中粉组与模型组比较有统计学意义(P＜0.01);麝香保心丸组与各益气活血通痹小复方组比较无统计学意义(P＞0.05);益气活血通痹小复方各组间比较也无统计学意义(P＞0.05)。详见表4。

表4 各组左心室内压最大下降速率的变化(±s)

表4 各组左心室内压最大下降速率的变化(±s)

组别 n 10 min 30 min 60 min 90 min 120 min假手术组 9 -1 877±353 -1 762±330 -1 581±306 -1 477±259 -1 497±206模型组 8 -992±2911) -953±2461) -882±2271) -897±2671) -914±2881)粗粉组 7 -1 180±4731) -1 120±2071) -1 101±1951) -1 075±2471) -1 102±2941)中粉组 8 -1 075±3761) -1 259±2321)3) -1 128±2551)3) -1 075±2871) -1 086±2111)超微细粉组 8 -1 147±3461) -1 223±3051)3) -1 082±3771) -1 037±2571) -1 118±2411)煎剂组 8 -1 227±3911) -1 181±2831)2) -1 066±1721) -1 056±2451) -1 037±1941)麝香保心丸组 7 -1 197±3631) -1 198±3421)2) -1 057±3521) -1 057±3981) -1 041±3611)与假手术组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.2 各组CF的变化 在各时间点,模型组冠脉流量减少明显,与假手术组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。在各时间点,超微细粉组与模型组比较,能显著改善冠脉流量的减少(P＜0.05或P＜0.01)。中粉组在除灌流10 min外其他各时间与模型组比较有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。麝香保心丸组与益气活血通痹小复方各组比较无统计学意义(P＞0.05)。益气活血通痹小复方各组间比较也无统计学意义(P＞0.05)。详见表5。

表5 各组冠脉流量的变化(±s)mL

表5 各组冠脉流量的变化(±s)mL

组别 n 10 min 30 min 60 min 90 min 120 min假手术组 9 11.18±2.28 11.22±2.24 11.16±1.97 11.38±1.81 10.58±1.80模型组 8 6.12±2.651) 6.00±2.711) 5.60±2.751) 4.90±2.901) 4.72±2.531)粗粉组 7 7.82±2.701) 7.66±2.541) 7.16±2.471) 7.14±2.191) 6.72±1.971)中粉组 8 7.24±2.371) 8.36±2.291)2) 7.94±2.351)2) 7.58±2.421)3) 7.06±2.241)3)超微细粉组 8 8.84±2.861)2) 8.74±2.761)3) 8.38±3.221)3) 8.10±3.071)3) 7.76±2.931)3)煎剂组 8 7.48±2.331) 7.44±2.181) 7.84±2.531) 6.76±2.671) 6.62±2.621)麝香保心丸组 7 8.08±3.121) 7.73±3.271) 7.42±2.861) 6.76±2.411) 6.55±2.281)与假手术组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.3 心肌HE染色 光镜下观察可见:假手术组心肌组织未见充血、出血或炎细胞反应,心肌细胞排列整齐,核大,染色较淡。模型组各例均有不同程度因缺血而引起的心肌损害,主要表现为心肌纤维变长,排列紊乱而疏松,呈波浪形,肌纤维间距增宽,间质轻度水肿,充血或出血,少许炎细胞反应,并出现局灶性坏死。治疗组心肌细胞的损伤程度较轻,主要表现为肌纤维排列呈波浪形,细胞肿胀,偶见少量淤血,但未见肌纤维变形断裂。其中,超微细粉组损伤最轻,仅见小部分细胞水肿。

3 讨 论

近年随着介入性心脏学、冠脉内球囊扩张血管成形术、冠脉内溶栓、激光汽化等冠脉血管再通和再造术的完善,使冠脉血栓和严重狭窄的心肌缺血重新恢复了血液供应,心肌的再灌注损伤也越来越受到人们的重视,揭示心肌缺血与再灌注损伤的发生机制,己经成为现代心血管疾病防治中的关键课题之一。

心肌缺血时由于代谢障碍致ATP减少,细胞内K+丢失,无机磷酸盐增多,细胞内酸中毒,引起心肌的兴奋-收缩耦联障碍,心肌收缩力减弱[5],所以心肌缺血往往伴随血流动力学及心脏功能的改变。影响心功能的主要因素包括心肌收缩功能、心率和前后负荷。其中,心肌收缩功能是决定心功能的内在因素。在血流动力学各项指标中,+dp/dtmax间接地反映了心肌纤维收缩成分的缩短速度,对变力性干预较敏感,具有较大的实用价值,是反映心肌收缩功能的较好的指标。LVSP升高在一定程度上反映了心肌收缩力的增加[6]。-dp/dtmax反映了心室舒张时心肌纤维伸长的最大速度,是衡量左心室舒张期顺应性及心肌僵硬度的重要指标之一,可间接反映左心的舒张功能。LVEDP升高除表示心脏前负荷增加外,也间接反映心肌的舒张顺应性。总的来说,LVSP、+dp/dtmax反映左室收缩功能,LVEDP、-dp/dtmax反映左室舒张功能[7]。

心肌缺血时,钙超载、能量代谢障碍、自由基的大量产生及乳酸和H+等酸性产物的堆集均可引起细胞的结构和功能受损,使缺血细胞发生病理形态学改变[8]。

上海中医药大学附属龙华医院周端教授在长期的临床实践中认识到,疾病发生的根本原因在于阴阳失调,疗疾病的目的就是“谨察阴阳所在而调之,以平为期”。认为冠心病属中医胸痹范畴,证属本虚标实,气虚血瘀是冠心病发病的病理基础,故治疗以益气活血通痹为主要治法,生晒参、三七、麝香此三药是导师根据主要治则及多年临床经验优选出来的三味药,生晒参为君,大补元气,广益五脏,针对气虚的主要病机;三七为臣,活血通络,止血消瘀,消肿止痛,两药相合,气行则血行,血行则气实;麝香为佐,辛香走窜,开窍通络,宣痹止痛,引药直达病所。三者配伍,共奏益气活血,通痹止痛之功。三药药少精当,配伍合理,切中病机。

前期研究[1,2]提示:三七和人参及其复方制剂微粉中的三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的体外溶出速度和溶出量不比常规机械粉碎的粉末有优势。在不同目数的粉末中,中粉(65目～100目)指标成分的溶出速度和累计溶出量较其他目数更好。因此本实验保留了中粉组与超微细粉组作对照。本研究发现:通过形态学观察表明,缺血 60 min,再灌120 min存在明显的心肌缺血/再灌注损伤,益气活血通痹小复方可减轻心肌缺血的病理性损伤程度。益气活血通痹小复方能够改善缺血心肌收缩功能(LVSP、+dp/dtmax),以中粉、超微细粉效果最佳。

[1] 周昕,谢瑞芳,周端,等.粉碎度对生晒参有效成分含量和溶出度的影响[J].上海中医药杂志,2008,42(11):87-89.

[2] 周昕,谢瑞芳,周端,等.三七微粉与普通粉中有效成分的含量和溶出度比较[J].上海中医药杂志,2009,43(10):79-81.

[3] 周文武,林玲,陈军,等.冠脉结扎法制作大鼠心肌缺血模型[J].中国实验动物学报,2004,12(4):226-230.

[4] Samsamshariat SA,Samsamshariat ZA,Movahed M R.A novel method for safe and accurate left anterior descending coronary artery ligation for research in rats[J].Cardiovascular Revascularization Medicine,2005(6):121-123.

[5] Ji L,Edward J,Miller,et al.AM P-activated protein kinase activates p38 mitogen-activated protein kinase by increasing recruitment of p38 MAPK in the ischemic heart[J].Circ Res,2005,97:872-879.

[6] 邵耕.现代冠心病[M].北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1998:53-54.

[7] 云霞.心肌力学和心肌收缩性能的评定[J].生理科学进展,1980,11(3):212.

[8] 程晓昱,胡业彬,王怀美.复方真武冲剂对家兔实验性心力衰竭的血流动力学影响[J].中国中医急症,2005,14(10):985-986.