秦欢欢,王学锋,许冠群,陆晔玲,丁秋兰,戴 菁,奚晓东,王鸿利

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院、上海血液学研究所;医学基因组学国家重点实验室,上海200025;2.上海交通大学医学院附属瑞金医院临床输血科)

血小板无力症是由于血小板糖蛋白IIb(GPIIb)或者IIIa(GPIIIa)的基因缺陷导致血小板对多种诱导剂(如腺苷二磷酸、胶原、花生四烯酸、肾上腺素)先天性、遗传性反应减低甚至无反应。本病为一种常染色体隐性遗传的血小板功能障碍性疾病。血小板无力症根据GPIIb/IIIa复合物量的减少或者质的异常分为3型:Ⅰ型GT(IIb/IIIa＜5%)占大多数(78%)。Ⅱ型GT(IIb/IIIa占5%-25%)约占14%。Ⅲ型GT(IIb/IIIa)又称变异型GT约占40%-100%。目前关于GT基因缺陷报道包括基因点突变、缺失、插入、重排,绝大多数为点突变。本研究中对3例血小板无力症家系进行临床诊断和家系调查共发现6种纯合性基因突变,其中先证者3基因纯合性插入及多位点突变为国际首次报道。

1 对象与方法

1.1 家系资料

家系1:先证者,女,14岁。出生后3-4天就有皮肤出血点、口腔牙龈出血。12岁初潮,月经量多持续时间长。其母有鼻出血,但月经量不多。其父无出血史。家系图见图1a。

家系2:先证者,女,14岁。出生后10个月开始鼻出血,感冒后会自发性鼻出血、牙龈出血。皮肤可见明显出血点。其外公及爷爷有出血病史。家系图见图1b。

家系3:先证者,女,12岁。自幼有牙龈出血、鼻出血、耳出血、咽出血及皮肤瘀斑,家族无类似出血病史。家系图见图1c。

以上3个家系先证者均为汉族,父母为近亲婚配。

图1 三个遗传性血小板无力症家系图

1.2 方法

1.2.1筛选试验 血小板计数及模板法检测出血时间(BT),全血涂片观察血小板的形态和分布。

1.2.2确诊实验 二磷酸腺苷(ADP)、肾上腺素、花生四烯酸、胶原和瑞斯托霉素诱导的血小板聚集试验(PAgT)及全血法流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测血小板表面CD41(αⅡb)和CD61(β3)表达。

1.2.3排除实验 通过检测常规凝血项目包括活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)及纤维蛋白原(Fg)含量排除凝血障碍性疾病,通过检测血管性血友病因子抗原(vWF:Ag)及其活性(vWF:A)以排除血管性血友病(von Willebrand’s disease,vWD)。

1.2.4αⅡb及β3基因分析 采集先证者及家系成员外周血2.7 ml,1∶9枸橼酸钠抗凝,立即4℃、3 000 r/min离心15 min收集上层血浆。利用北京天根生物公司DNA抽提试剂盒抽提先证者及其家系成员外周血基因组DNA。引物序列及反应体系条件见参考文献[1,2]。先扩增先证者αⅡb及β3基因各外显子及侧翼序列,PCR产物经割胶纯化后,用末端标记双脱氧法标记后测序(美国ABI公司DNA测序仪ABI3130XL),用Chromas软件将测序结果与美国NCBI基因库所公布的序列进行比对,3次正反测序证实。家系成员DNA仅在先证者αⅡb及β3基因突变区域扩增、纯化后测序,以确定突变基因的存在及突变类型。同时针对新的突变位点,通过检索单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)及对100名健康人中进行相应区域的PCR扩增、纯化后DNA直接测序的方法进行多态性筛查。通过查询ISTH数据库(http://sinaicentra1.mssm.edu/intranet/research/glanzmann)及相关文献查询证实新突变。

2 结果

2.1 实验室检测结果

2.1.1血涂片3个先证者全血涂片观察血小板形态正常,多散在分布、不聚集,血小板计数均正常。出血时间均延长。

2.1.2PAgT 3个先证者对二磷酸腺苷(ADP)、肾上腺素、花生四烯酸、胶原等生理性诱聚剂反应低下或者无反应,而对瑞斯托霉素的反应基本正常。全血流式细胞术检测发现3例先证者血小板膜表面αⅡβ3表达明显减少甚至缺如。

2.1.33个先证者及其家系成员的凝血四项检查(包括APTT、PT、TT、Fg)及vWF:Ag 及vWF:A 均基本正常。家系成员检测结果略。(见表1)。

2.1.4αⅡ及β3基因分析

3个先证者αⅡb基因30个外显子及侧翼序列及β3基因15个外显子及侧翼序列通过Chromas软件分析,αⅡb及β3基因分别与Genebank数据库中(GI:195546903)及(GI:195546904)比对,共发现6种纯合突变均位于αⅡb基因上(见表2)。先证者1在αⅡb基因的17号外显子存在14502C＞T纯合性突变,其母亲具有与其相同的C＞T杂合性改变。先证者2在αⅡb基因26号外显子存在18859C＞T纯合性突变,其父亲、母亲、弟弟及其他部分家系成员具有与其相同的杂合性突变。先证者3在αⅡb基因的15号外显子第14103-5 14104位核苷酸之间发生纯合性插入T(14103-14104insT),同时又发生3个点突变14105A＞C、14106G＞C、14107A＞T导致编码GPIIb蛋白的第418-483位氨基酸发生移码突变。其父亲、母亲、奶奶及曾外婆具有与其相同的杂合性插入及3个杂合性点突变(图2)。

表1 3例GT家系先证者实验室检测结果

表2 3例GT家系先证者基因检测结果

图2 3个先证者及部分家系成员测序图

3 讨论

整合素αⅡbβ3是血小板膜上表达最丰富的一种糖蛋白,当血小板处于活化状态时,可以结合纤维蛋白原、血管性血友病因子(vWF)及纤维连接蛋白等多种黏附分子,在血小板黏附聚集过程中起关键作用。整合素αⅡbβ3是一种钙离子依赖性异二聚体,在钙离子参与下以1∶1比例构成复合物,αⅡb或者β3任一亚基发生突变都会影响复合物的形成及细胞表面的表达,从而导致血小板无力症。

本研究中3例先证者父母均为近亲婚配,先证者自幼就反复出现皮肤瘀斑、瘀点,鼻出血及牙龈出血,临床表型诊断血涂片可见形态正常的血小板分散存在无聚集,血小板计数正常,出血时间明显延长,凝血象正常,血小板对多种生理性诱导剂反应低下或者缺无,而对瑞斯托霉素反应正常或者接近正常。流式细胞术发现αⅡb及β3含量比正常人明显减低,确诊为GT。由于GT是一种常染色体隐性遗传病,杂合子通常不发病,本研究中的3个先证者均为纯合性基因突变,父母均为该位点的杂合性基因突变。3例先证者的父母临床上均无出血表现。

家系1先证者在αⅡb基因的17号外显子存在14502位存在C→T的纯合基因突变,导致553位氨基酸由精氨酸(R)变为终止密码子(stop),母亲为该位点的杂合性突变,父母为近亲婚配,推测其父亲也应为该位点的杂合性突变。该位点突变是引起GT的热点突变,包括本研究中家系1在内已在10例GT患者中有报道,其中8例无血缘关系[3-6]。该突变发生在17号外显子的3’端剪切位点附近,有文献报道此突变可以激活17号外显子内潜在剪切位点,导致17号外显子末端75 bp的缺失,导致相应的25个氨基酸的缺失[6]。

家系2先证者在αⅡb基因的26号外显子存在18859位存在C→T的纯合基因突变,导致860位氨基酸由谷氨酰胺(Q)变为终止密码子(stop),父母亲为该位点的杂合性突变,本研究小组于2008年1月及2009年3月两次报道过该位点的杂合性突变[7,8],提示该位点也是引起I型GT的热点突变。本研究小组曾在2007年做过该突变位点的体外表达试验,共转染αⅡb Q860stop突变质粒及野生型质粒β3的293T细胞培养48小时后收获细胞,Western blot显示其细胞内GPIIb蛋白含量与共转朵野生型αⅡb及P3质粒的细胞明显差异,但蛋白分子量明显降低,提示终止密码的提前出现,造成了蛋白翻译的提前终止,产生了截断蛋白[8]。之前也有报道发生在26号外显子纯合突变870位丝氨酸(Ser)突变为终止密码子,该突变导致αⅡb的穿膜区及胞质区的缺失,产生截断蛋白能与β3亚基在内质网中形成复合物,但不能进行翻译后加工,导致不能成熟表达于血小板表面[9],导致GT发生。

家系3先证者在αⅡb基因的15号外显子靠近3’端14103与14104位之间纯合性插入T,导致移码突变,同时其后的3个核苷酸又发生纯合性点突变,分别为14105A＞C、14106G＞C、14107A＞T,其父母、奶奶及曾外婆均为与其相同的杂合性插入突变及杂合性点突变,可见这个插入突变与之后的3个点突变位于同一条染色体上。此插入性突变之后又引起的多个位点的点突变目前国际上尚未有类似报道[10]。笔者推测可能由于插入碱基T后引起血小板糖蛋白IIb结构变化,蛋白结构不稳定导致之后多个位点发生点突变。先证者的父母为近亲婚配,父母均具有与先证者相同的杂合突变。流式细胞术检测结果显示αⅡb及β3均降低至1%左右,推测此插入突变及多个位点的点突变可能改变αⅡb糖蛋白空间结构,影响αⅡbβ3复合物的形成,导致 I性GT发生[11,12]。关于此多个位点复合突变对αⅡbβ3复合物合成转运及功能的影响需进一步研究证实。

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