赵 岩,林风武,李 才,王丽娟,巴丽薇

(1.吉林大学第二临床医院内分泌科,吉林长春130041;2.吉林大学中日联谊医院胸外科;3.吉林大学药学院实验药理与毒理学教研室)

尾加压素Ⅱ(UⅡ)是新近发现的一种在生物界广泛存在的生长抑素样环状结构神经肽,是一种自分泌/旁分泌生长因子。研究发现,UⅡ对肾小球系膜细胞(MC)具有促丝裂作用[1],可能在糖尿病肾病(DN)发病机制中具有一定作用。本实验观察了UⅡ对体外高糖培养的MC纤连蛋白(FN)、IV型胶原(Col IV)mRNA表达的影响,旨在为进一步探讨UⅡ在DN发病中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠肾小球系膜细胞系购自上海坤肯生物化工有限公司;尾加压素Ⅱ购自美国Sigma公司;山羊抗大鼠UⅡ多克隆抗体购自Santa Cruz公司;PCR引物由上海生工生物技术公司合成;英国Techne TC-312 PCR扩增仪;德国Hermle/2K38离心机。

1.2 方法

1.2.1细胞培养和干预 选用传代至5-10代生长良好的MC,经0.25%胰蛋白酶消化,制成单个细胞悬液,以每孔1×104的细胞数接种于12孔培养板中。当生长至覆盖瓶底面积70%时,更换无血清DMEM培养液,培养24 h后按下述干预条件进行分组:①对照组;②UⅡ组:终浓度10-8mol/L;③UⅡ+Ca2+通道阻断药尼卡地平组(尼卡地平,10-5mol/L,提前5 min加入);④UⅡ+Ca2+螯合剂 EDTA组(EDTA 2×10-3mol/L,提前30 min加入);⑤UⅡ+UⅡ抗体组(抗UⅡ抗体10-5mol/L,提前60 min加入)。每孔设6个复孔,培养24 h。

1.2.2RT-PCR检测FN、ColⅣmRNA表达水平

1.2.2.1细胞总RNA提取及RNA纯度测定 上述各组细胞弃上清,PBS冲洗后加入Trizol提取细胞总RNA。紫外分光光度计测260 nm/280 nm处紫外吸收值,重复三次取平均值。结果各组A260/A280在1.8-2.0之间,说明所提取RNA纯度高。

1.2.2.2逆转录反应 采用30 μ l反应体系。-20℃保存备用。

1.2.2.3引物合成 根据基因库检索大鼠FN、ColⅣ及内参对照物GAPDH mRNA序列,应用引物设计 软件设计引物,由上海生工生物技术公司合成。……