于庆功,常慧丽,李明强,舒 敏,王 伟,刘春英

(大连大学附属中山医院消化科,辽宁大连116001)

Syk(Spleen tyrosine kinase)是一种B细胞激活信号转导中最重要的激酶[1]。近来对Syk与肿瘤相关性研究证实,Syk可以抑制多种恶性肿瘤的生长,从而引发了对非受体酪氨酸激酶在肿瘤发生发展和转移过程中作用的研究。肿瘤的发生发展转移是多阶段、多因素的复杂过程,其中逃避免疫监视则是最为重要的环节之一[2]。因此,分析与Syk基因有关的抗肿瘤免疫活性,探讨因Syk表达缺失而导致的肿瘤免疫逃逸作用及其机制具有十分重要的价值。本研究将Syk基因克隆到逆转录病毒载体中,在脂质体作用下将该载体转染人结肠腺癌细胞LoVo,检测该细胞的生长周期变化。

1 材料与方法

1.1 材料

人结肠腺癌细胞系LoVo购自中国科学院上海细胞库。DH5α,逆转录病毒载体 pLNCX为本室保存。PCR试剂盒、反转录PCR扩增试剂盒、DNA连接试剂盒和限制性内切酶购自宝生物大连有限公司 。TRIzolTM Reagent、Lipofectamin、Genecitin 购自GIBCO BRL公司。

1.2 方法

1.2.1目的基因的聚合酶链反应(PCR)按TR I-zol试剂盒说明书提取脾脏组织总RNA,根据反转录和PCR试剂盒操作说明扩增Syk cDNA。根据Gen-Bank中登录的Syk cDNA序列设计引物,上游引物序列为:5′2CACC ATG GCC AGC AGC GGC ATGGCT G23′,下游引物序列为 :5′2GTT CAC CAC GTC ATA GTAGTA ATT GCG23′。hGAPDH PCR 引物:5′-TCC TCT GAC TTC AAC AGC GAC ACC-3′和 5′-TCT CTC TTC CTC TTG TGC TCT TGG-3′。扩增产物用 5 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.2Syk基因逆转录病毒表达载体的构建 收集脾脏组织细胞,一步法提取细胞总RNA,经逆转录合成cDNA,以特异引物进行PCR扩增,其扩增长度为1909bp。循环参数为:预变性94℃1分钟,变性98℃10秒;退火55℃30秒;延伸72℃1分钟,循环30次,后延伸72℃5分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,回收。……