朱新江* 张 凯 秦 伟 冯 禄

胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，在我国胃癌病死率为25.2/10万（男性32.8/10万，女性17.0/10万），占全部恶性肿瘤死亡的23.2%（男性是女性的1.9倍），严重威胁人民群众的生命健康。近几年，表遗传学改变的研究取得了突飞猛进的进展，成为胃癌临床基础研究的一个前沿阵地。p16基因是已经确认的最重要的抑癌基因之一，在胃癌细胞凋亡过程中起着重要作用[1-3]。

1 材料与方法

1.1 一般资料

表1 p16基因和GAPDH的RT- PCR引物序列及PCR条件

表2 p16基因甲基化和非甲基化引物序列及PCR条件

选择2005年1月至2008年1月抚顺市中心医院普外科切除的胃癌患者50例，男44例，女6例，年龄40～74 岁，平均（58±9.76）岁。手术取下的新鲜标本立即浸入液氮中后置于-70℃冰箱保存。 Wizard DNA cleap up 纯化试剂盒（美国Promega公司），亚硫酸氢钠（美国Sigma公司），SYBR GreenI 实时定量PCR逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司），TRIzol（美国Invitrogen公司），Taq酶和dNTP（日本TaKaRa公司）引物（北京三博远志生物技术有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 RT-PCR分析胃腺癌标本中p16基因MRNA的表达

用TRIzol 试剂一步法分别提取胃癌组织总RNA（按说明书进行）。按照反转录试剂盒说明将其反转录成cDNA第一链。PCR反应条件：首先进行预变性，时间为4min，预变性温度为93℃。预变性之后进行35个循环：温度和时间分别为 92℃ 30s、51℃ 30s，71℃ 45s，最后延伸10min温度为72℃。用琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物，GB染色，利用凝胶成像分析系统检测PCR产物吸光度值，将各基因与GAPDH吸光度比值作为其mRNA水平的相对值，mRNA表达水平取其平均值进行统计分析。

1.2.2 甲基化特异性PCR检测p16基因启动子区DNA甲基化

首先用酚-氯仿分别提取胃癌组织中基因组DNA，并用紫外分光光度仪进行定性、定量。……