王铁东，王秋石，王俊科

（1.辽宁中医药大学 附属医院麻醉科，沈阳 110032；2.中国医科大学 附属第一医院麻醉科，沈阳 110001）

神经病理性疼痛（neuropathic pain）是外周或中枢神经系统病变或损伤引起的疼痛［1］，常见的有糖尿病型神经痛、三叉神经痛、带状疱疹后神经痛、脊髓损伤后神经痛以及各种损伤、炎症或手术后遗留的神经痛，这些疾病的共同特点是它不同于由于组织损伤而导致的急性疼痛，通常呈慢性、可持续数日或数月。丙戊茶碱（propentofylline）能透过血脑屏障，具有细胞膜稳定的作用，目前在实验研究中认为丙戊茶碱是胶质细胞的调节剂，是通过抑制磷酸二酯酶从而增强cAMP的信号传导途径来降低中枢的敏感性，主要是对胶质细胞的激活和前炎性细胞因子释放的抑制作用。此外丙戊茶碱还是腺苷“重摄取”的阻滞剂［2］，而后者可以抑制小胶质细胞的分裂。本实验观察丙戊茶碱对坐骨神经分支选择性损伤（spared nerve injury，SNI）模型大鼠痛阈的影响和脊髓中炎性细胞因子及腺苷受体（adenosine receptor，AR）的变化，以探讨丙戊茶碱对神经病理性疼痛的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物选择与分组

雄性SD大鼠96只，体质量（250±20）g。本实验严格按照国际疼痛学会（IASP）关于应用清醒动物进行疼痛实验研究纲要的要求来实施和完成。

大鼠随机分为4组，假手术（Sh）组、模型（S）组、鞘内注射丙戊茶碱（P1）组及腹腔注射丙戊茶碱（P2）组，每组24只。假手术组仅暴露坐骨神经，不牵拉和损伤神经。其中S组和P1组造模后分别单次鞘内注射盐水20μl和丙戊茶碱20μl（0.05μg/μl）；P2组造模后单次腹腔内注射丙戊茶碱1ml（1 mg/kg），盐水和药物的应用至取材点。各组分别在术前1 d 及术后 1，3，7，14，21 d 的上午测量行为学指标，并于术后1，7，14，21 d处死大鼠，并取大鼠腰段脊髓测定炎性细胞因子和腺苷A1受体（A1-AR）的含量。每组每个时间点各取6只大鼠。

1.2 实验方法

1.2.1 坐骨神经分支SNI模型制备：参照文献［3］进行制备。

1.2.2 鞘内注药的方法：参照Mestre等［4］方法进行。

1.2.3 机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）测量法［5］：用 von-Frey 纤维分别刺激大鼠足底部位，保持垂直，加力，致纤毛出现弯曲，持续时间≤4 s。大鼠出现抬足或舔足行为视为阳性行为，刺激强度首先从8 g开始，如出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激。如此连续进行，直到出现第1次阳性和阴性反应的骑跨，再连续测定4次。每次刺激间隔15 s。出现2/3次缩足反应的最低力度值为测量结果。

1.2.4 热缩足反射持续时间（thermal withdrawal duration，TWD）测量法［6］：按 Hargreaves法用 BME-410型热痛刺激仪对准大鼠足底紧贴玻璃板部位。刺激光强度设置为能使正常大鼠在12~15 s左右发生缩足反应的强度，同时为避免大鼠足底的烫伤，热刺激时间的上限设定为30 s。当大鼠出现缩足反射时立即按下秒表计时，待缩足反射消失时停止计时，从出现缩足反应到缩足反应消失的时间即为热缩足反射维持时间（s）。

1.2.5 细胞因子TNF-α和IL-1β的测定：在各时间点将大鼠深麻醉（戊巴比妥钠100 mg/kg）后，迅速截取脊髓腰膨大，将脊髓组织用微量研磨器磨碎制成匀浆液，将匀浆液进行30倍稀释后用ELISA试剂盒检测，按试剂盒说明进行操作。

1.2.6 A1-ARWestern-Blot法检测：取脊髓腰膨大并快速置入-80℃冰箱保存待用。称取100 mg脊髓标本，冰上剪碎后，加入1 ml匀浆液，冰上孵育30 min，再4℃20 000 g离心30 min，沉淀以缓冲液悬浮，4℃振荡混匀，再4℃20 000 g离心20 min，取上清，蛋白定量，灌制8%SDS-PAGE凝胶，每孔上样量50μl进行电泳，电转膜，3%牛血清封闭3 h后，与A1-AR一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，TBST冲洗15 min×3次，加入碱性磷酸酶标记的二抗（1∶1 000），室温震荡孵育 1.5 h，TBST冲洗 15 min×3次，用NBT/BCIP试剂盒显色，用自动电泳凝胶成像系统采集图像，然后用Scion Image软件对免疫印迹条带进行半定量分析。

1.3 统计方法

所有数据均以x±s表示，所得数据经SPSS11.5软件处理，组间比较用方差分析，P<0.05认为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察结果

术前各组大鼠的两种疼痛行为学指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）；S组从术后1 d开始患足的MWT值即出现显著下降，TWD值明显延长，与术前基础值和Sh组比较差异有统计学意义（P<0.01），且这种变化趋势持续至术后21 d。P1组和P2组能使大鼠患足MWT值的下降幅度及TWD值的上升幅度减少，与S组比较有统计学差异（P<0.05）；而且P1组对大鼠MWT和TWD值的影响优于P2组，其结果有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 脊髓水平TNF-α和IL-1β表达量的变化

与术前基础值和Sh组比较，S组脊髓的细胞因子TNF-α和IL-1β的含量明显增加，在术后1 d起就开始增高，于术后7 d达到高峰，14 d时仍然较高（P<0.05），于术后21 d明显下降，与之相比较，其中P1、P2组与S组比较TNF-α和IL-1β增加的幅度小，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表1 各组大鼠术前及术后MWT和TWD的变化（x±s）Tab.1 Changes in MWT and TWDbefore and after operation in each group（x±s）

2.3 大鼠脊髓A1-AR的实验结果

SNI模型使大鼠脊髓腺苷A1受体的表达有较明显的降低，于术后1 d开始其蛋白表达量下降，并持续至术后21 d，与Sh组比较差异有统计学意义（P<0.01）。P1组和P2组能使脊髓A1受体的表达增加，与S组比较有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表2 各组大鼠术后脊髓TNF-α和IL-1β含量的变化（x±s）Tab.2 Changes in the levels of TNF-α and IL-1β after operation in each group（x±s）

3 讨论

中枢神经胶质细胞功能的改变及细胞内信号传递的改变在神经病理性疼痛的产生与维持起着关键的作用。在慢性炎症及神经损伤引起的伤害性感受中，大量的胶质细胞被激活，直接或间接地产生一些炎性介质或细胞因子，从而加强神经病理性疼痛的形成。对强啡肽诱导异常性疼痛发生的小鼠鞘内注射IL-1受体拮抗药（IL-1ra）、IL-10或NF-κB抑制药等，均可缓解异常性疼痛［7］。因此认为在脊髓水平调整细胞因子的活性可能是治疗慢性疼痛的有效措施。

本实验采用大鼠SNI模型，模拟了临床神经病理性疼痛的多个特点。结果大鼠在术后1 d就表现出明显的机械痛敏和热痛敏，热痛敏表现为热缩足反射维持时间延长，提示SNI模型早期即出现了中枢（脊髓）敏化。在SNI模型中，炎性细胞因子TNF-α和IL-1β含量的变化，于术后7 d达到高峰。使用丙戊茶碱后能够明显地改善机械痛敏和热痛敏反应，并且也能明显抑制炎性细胞因子的释放。有研究显示，增强的依赖性cAMP信号系统增加了抗炎性细胞因子IL-10的表达［8］。因此，认为丙戊茶碱可能是增强了抗炎性细胞因子的产生并依次下调炎性细胞因子的产生。IL-1β、TNF-α的产生也导致了病理性胶质细胞的激活，不仅加重了继发的神经元损伤，而且也增加了中枢的敏感性和行为学的痛敏。

表3 全组术后各时点A1-AR表达的相对光密度值（x±s）Tab.3 Relative optical density of the expression of adenosine A1 receptor after operation in each group（x±s）

丙戊茶碱也是腺苷再摄取的抑制剂。临床研究发现同样遭受神经损伤的患者却拥有不同程度的病理性疼痛，神经病理性疼痛较严重的患者其脑脊液中腺苷的水平较低［9］。在实验中鞘内给予腺苷降低了由芥子油继发的痛敏程度。腺苷是由脊髓的A1-AR介导的，本研究中A1-AR蛋白含量的表达在SNI模型中降低，丙戊茶碱作用后其含量的表达有增强的趋势。表明A1-AR在病理性疼痛中发挥了作用，然而丙戊茶碱是直接作用于A1-AR还是间接对受体起作用，以及受体功能如何改变，尚需进一步研究。

［1］Mersky H，Bogduk N.Classification of Chronic Pain ［M］.2nd edn.searrle：IASPPress，1994：394.

［2］Wu WP，Hao JX，Halldner L，et al.Increaseed nociceptive response in mice lacking theadenosine A1 recepter［J］.Pain，2005，113（3）：395-404.

［3］Decosterd I，Woolf CJ.Spared nerve injury：an animal model of persistent peripheral neuropathic pain ［J］.Pain，2000，87（2）：149-158.

［4］Mestre C，Pelissier T，Fialip J.A method to perform direct transcutaneousintrathecal injection in rats［J］.JPharmacol Toxicol Methods，1994，32（4）：197-200.

［5］Kingery WS，Castellote JM，Maze M.Methylprednisolone prevents the development of autotomy and neuropathic edema in rats，but has noeffect on nociceptivethresholds［J］.Pain，1999，80（3）：555-566.

［6］Hargreaves K，Dubner R，Brown F，et al.A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia［J］.Pain，1988，32（1）：77-88.

［7］Sakaue G，Shimaoka M，Fukuoka T，et al.NF-kappa B decoy suppressescytokine expression and thermal hyperalgesia in a rat neuropathic pain model［J］.Neuroreport，2001，12（10）：2079-2084.

［8］Park PH，Huang H，McMullen MR，et al.Activation of cyclic-AMP responseelement bindingprotein contributestoadiponectin-stimulated interleukin-10 expression in RAW 264.7 macrophages ［J］.J Leukocyte Biol，2008，83（5）：1258-1266.

［9］Wu WP，Hao JX，Halldner L，et al.Increased nociceptiveresponse in mice lacking the adenosine A1 recepter［J］.Pain，2005，113（3）：395-404.