杨军，胡新华，范玥尧，何家安，衣正贵，张强

（1.中国医科大学 附属第一医院外科，沈阳 110001；2.辽阳市太子河医院 外科，辽宁 辽阳 111000）

周围血管手术、腹主动脉瘤、断肢再植或周围血管损伤等疾病治疗过程均不可避免地造成肢体缺血。尽快恢复充足的血供是缺血肢体组织成活的关键，然而缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤能够导致远隔器官（如肺、肾、小肠等）的功能损害［1］。缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）能够减轻肢体缺血再灌注后肺损伤，其作用机制可能是通过抑制细胞间黏附分子1（intercellular adhension molecule-1，ICAM-1） 介导的中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）在肺组织内的黏附、浸润而实现的［2］。近来，人们在研究中发现缺血后处理（ischemic postconditioning，I-postC）同样能提高机体对缺血的耐受性［3］。本研究观察I-postC对大鼠双侧后肢I/R模型肺损伤的影响，探讨其作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型

48 只雄性 Wistar大鼠，（250±50）g，由中国医科大学实验动物中心提供，随机分为I/R组、IPC组及I-postC组（n=16），每组再随机分为12 h或24 h两个亚组（n=8）。2%戊巴比妥钠40 mg/kg行腹腔麻醉，腹部正中切口、分离肾下腹主动脉。I/R组采用无创性血管夹夹闭腹主动脉4 h，之后移去动脉夹恢复血流再灌注12 h或24 h。IPC组采用无创动脉夹夹闭腹主动脉5 min，开夹再灌注5 min，反复3轮进行缺血预处理，然后按I/R组程序操作。I-postC组采用无创性血管夹夹闭腹主动脉4 h后，开夹再灌注1 min，夹闭1 min，反复3轮进行缺血后处理，然后开夹彻底恢复血流灌注，分别于再灌注12 h或24 h结束实验。各组分别在12 h、24 h取材双肺，液氮中快速冷冻后置-70℃冰箱中保存。

1.2 组织学研究

取部分肺叶固定、包埋，制成4μm厚切片，苏木素-伊红HE染色。计数肺泡间隔中的PMN数代表肺部扣押的PMN，计数10个高倍视野，取平均数。

1.3 肺组织湿/干重比

取部分肺标本称重，然后置入真空干燥器中50°C烘烤24 h，称量组织重量。24 h后重复，确定脱水完全。计算肺组织湿/干重比率作为肺水肿的标志。

1.4 肺组织丙二醛和髓过氧化物酶的检测

收集右肺上叶，按肺组织丙二醛（malondialdehyde，MDA） 和 髓 过 氧 化 物 酶（myeloperoxidase，MPO）试剂盒（购于南京建成公司）说明书检测肺组织中的MDA和MPO含量。

1.5 半定量RT-PCR

采用Trizol提取总RNA并逆转录为cDNA，PCR引物序列如下：ICAM-1上游引物：5′-TGCGTTTTGGAGCTAGCGGACCA-3′，下游引物：5′-CGAGGACCATACAGCACGTGCAG-3′（321 bp）；βactin 上游引物：5′-TTGTAACCAACTGGGACGATA-3′，下游引物：5′-GATCTTGATCTTCATGGTGCT-3′（608 bp）。PCR 条件：94℃变性 2 min，94°C30 s，56°C 30 s，72°C 60 s，共 30 个循环，72℃延伸 7 min。电泳后凝胶成像系统上摄像并分析各条带吸光度值。

1.6 原位杂交

肺组织标本置于含0.1%的4%多聚甲醛溶液中固定2 h，梯度蔗糖脱水，OCT包埋后冷冻切片。ICAM-1 mRNA检测试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司。正常静脉作对照，PBS代替探针作阴性对照。光镜下计数阳性细胞数。

1.7 Western blot蛋白印迹

剪碎肺组织后置于裂解液中机械匀浆，4℃低温10 000 r/min离心10 min。Coomassie Plus试剂盒测总蛋白质浓度。制备10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔加蛋白样品50μg，电泳后转膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗ICAM-1或actin（1∶1 000，山羊多克隆 IgG，Santa Cruz），4℃过夜，1∶1 000加入过氧化物酶标记的马抗山羊IgG-HRP 60 min，洗膜后加入ECL 1 min，暗室显影2~3 min后冲洗胶片。凝胶成像分析系统上摄像分析，计算吸光度值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 组织学变化

再灌注12 h或24 h后I/R组有明显的弥散功能障碍，表现为间质浸润细胞增多并伴有明显水肿。IPC和I-postC组与I/R组比较，上述各种表现明显减轻，PMN计数显著减少（P<0.01）。见表1。

表1 肺PMN计数、湿/干重比、MDA和MPO活性、ICAM-1表达比较（x±s）Tab.1 The changes of PMD counts，M/D ratio，MDA and MPO activity and expression of ICAM-1 in lung（x±s）

2.2 肺组织湿/干重比、MDA和MPO的检测

IPC组和I-postC组与I/R组比较，肺组织湿/干重比（W/D）明显减轻，差异有统计学意义（P<0.01）。但是，IPC和I-postC组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；IPC组和I-postC组与I/R组比较，肺组织MDA和MPO活性显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。IPC组和I-postC组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 半定量RT-PCR和原位杂交结果

RT-PCR扩增结果提示在I/R组12 h和24 h肺组织中ICAM-1 mRNA均有明显表达，而IPC和I-postC均能够显著抑制ICAM-1 mRNA表达。原位杂交提示ICAM-1 mRNA表达阳性细胞主要分布在支气管和肺泡。见表1。

2.4 Western blot蛋白印迹

Western blot检测结果显示：分别于108 kDa和43 kDa对应处出现ICAM-1和actin蛋白表达信号。I/R组在12 h及24 h的表达均很强，而IPC组和I-postC组的蛋白表达信号均显著弱于I/R组（图1，表1）。

3 讨论

多种外科操作，包括下肢血管重建以及应用止血带的手术，均可以使肢体产生缺血再灌注损伤。再灌注损伤能够启动系统性炎性反应综合征，产生大量炎性介子、激活血循环中的PMN。肺部微血管中的白细胞扣押及PMN激活是急性肺损伤的关键［4］。因此，清除或减少PMN对此类疾病导致的肺损伤有保护作用。本研究发现，I-postC和IPC均能够减少肺MDA含量，而MDA是反映脂质过氧化和氧自由基介导细胞损伤的标志。MPO作为肺PMN浸润的标志，I-postC和IPC后亦明显减少。我们推测二者均可能通过阻止ICAM-1基因的介导和参与来减轻肺损伤。

由于缺血性疾病的发生往往难以预知，使IPC的应用受到很大的限制。I-postC能在缺血发生后、再灌注之前进行，比IPC具有更为广阔的临床应用前景。许多学者采用不同动物的在体或离体心脏模型对比I-postC和IPC对I/R损伤的保护效应，发现二者存在相似之处：均有利于恢复心功能、缩小心肌梗死范围，减少心律失常的发生率［5］。新近研究表明［6］，I-postC能够保护动脉的内皮细胞功能，减轻中性粒细胞聚集，而IPC则没有这一作用，提示I-postC和IPC之间可能存在本质区别。本研究结果证实，I-postC能够显著减轻双侧后肢I/R所致急性肺损伤，与抑制ICAM-1的基因转录和表达有关。因此，I-postC在急性呼吸窘迫综合征或其他以中性粒细胞介导的组织损伤疾病中可能发挥重要的治疗或预防作用。

［1］Barry MC，Kelly CJ，Abdih H，et al.Differential effects of lower limb revascularisation on organ injury and the role of the amino acid taurine［J］.Eur JVasc Endovasc Surg，1997，13（2）：193-201.

［2］Yang J，Hu XH，Zhang Q，et al.Expression and significance of intercellular adhesive molecular-1 in lung after skeletal muscle ischemia/reperfusion injury［J］.JChin Med Univ，2004，33（4）：296-298.

［3］Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2003，285（2）：H579-H588.

［4］Klausner JM，Paterson IS，Valeri CR，et al.Limb ischemia-induced increase in permeability is mediated by leukocytes and leukotrienes［J］.Ann Surg，1988，208（6）：755-760.

［5］Vinten-Johansen J，Yellon DM，Opie LH.Postconditioning：asimple，clinically applicable procedure to improve revascularization in acute myocardial infarction［J］.Circulation，2005，112（14）：2085-2088.

［6］Loukogeorgakis SP，Panagiotidou AT，Yellon DM，et al.Postconditioningprotectsagainst endothelial ischemia-reperfusion injury in the human forearm［J］.Circulation，2006，113（7）：1015-1059.