张永红，贺兴鄂，唐晓鹏，王文龙，罗开忠

（中南大学 湘雅二医院肝病研究所，长沙 410011）

乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）的持续感染与肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生和发展密切相关［1］。虽然HBV感染引起HCC的发生机制尚未阐明，但研究发现HBV编码的X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx protein）可反式激活宿主和病毒基因的启动，具有广泛的生物学活性，85%HCC患者的肝组织中含有特异性的HBx蛋白，提示HB x基因在HCC的发生中发挥着关键性作用［2~4］。酿酒酵母YKL-40蛋白在恶性肿瘤组织中常被激活，在肿瘤的生长和转移中发挥着重要的作用。我们通过小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）使HB x基因沉默，研究了HBx蛋白对YKL-40蛋白表达的影响，不仅对探讨HBV相关性HCC的发生机制具有重要意义，还为通过阻断HBx蛋白表达影响肿瘤相关基因的表达来防治HCC提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株和肿瘤细胞：质粒pRNAT-U6.1/Neo（GenScript）、大肠杆菌DH5α、人肝癌细胞系HepG 2.2.15细胞均为本实验室保存。

1.1.2 试剂：T4 DNA连接酶、BamHI内切酶、HindⅢ内切酶、G418、小量质粒DNA纯化试剂盒等均购自Progmega公司；DNA marker和RT试剂盒购自Ferments公司；转染脂质体Lipofectamin 2000和Trizol regent购自Invitrogen公司；DMEM（高糖）和胎牛血清购自Gibco公司；鼠抗HBx一抗和鼠抗YKL-40一抗购自ABcam公司，鼠抗YKL-40一抗购自R&D公司，FITC标记兔抗鼠二抗、HRP标记兔抗鼠二抗购自Santa Cruz公司；DAB染色试剂盒购自KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA表达模板的设计与合成：针对HBV基因组中X基因选取一段靶序列：5′TGCTAGGGTGTGCTGCCAACT 3′，再根据这段序列按照质粒的要求设计一对siRNA模板，具有特殊的序列与结构，所表达的RNA为短发夹结构，见图1。另外，作为阴性对照，设计一条随机无关序列：5′CCTGCGTTGATGCCTTTGCCT 3′，根据这段序列再设计一对siRNA模板序列，由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 siRNA表达质粒的构建与鉴定：将上述合成的模板DNA链分别用水配成1μg/μl的溶液，各取5 μl，加入 2μl退火缓冲液（2 mol/L NaCl）和 8μl水，混匀后于95℃水浴5 min变性，自然冷却退火成双链DNA，与BamHⅠ和HindⅢ双酶切的质粒pRNAT-U6.1/neo连接，在T4连接酶作用下，16℃连接过夜；转化DH5α感受态细菌，于Amp阳性的LB平板上37℃培养过夜；挑取生长良好的单个菌落接种于Amp阳性的LB液体培养基中扩增，提取质粒测序鉴定。

1.2.3 细胞培养和转染：HepG2.2.15细胞使用含10%胎牛血清和G418（400μg/ml）的DMEM高糖培养基，置37℃、5%CO2的培养箱内培养，细胞贴壁生长至80%～90%融合状态时用0.25%胰酶消化进行传代培养。转染前1 d用0.25%胰酶消化培养瓶中的细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为5×105/ml，于60 mm×25 mm细胞培养皿加入3 ml细胞悬液，培养24 h左右，使细胞全部贴壁；按照Lipofectamin 2000说明书，于2个细胞培养皿中分别转染4μg质粒pRNAT-Neg和pRNAT-HBx。24 h后细胞使用有限稀释法，接种于96孔细胞培养板中，荧光显微镜下观察绿色萤光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达，筛选出阳性单细胞克隆，建立稳定细胞株，分别命名为2215-Neg和2215-HBx。将细胞设为空白对照组（2.2.15）、阴性对照组（2215-Neg）和实验组（2215-HBx），按 1×106/孔接种于6孔细胞培养板中，每组3个平行孔，培养72 h收获细胞。

1.2.4 RT-PCR检测HB x与YKL-40 mRNA的表达水平：采用Trizol法分别提取细胞总RNA，各取5μg RNA按照RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录获得cDNA，然后PCR扩增目的片段。HB x基因的PCR上游引物为 5′ATGGCTGCTAGGGTGTGCTG 3′，下游引物为 5′CGACGTACAGAGGTGAGGCG 3′，扩增产物片段大小为233 bp；YKL-40的上游引物为5′GGATGGAACTTTGGGTCTCA 3′，下游引物为 5′GCTGTTTGTCTCTCCGTCCA 3′，扩增产物片段长度为154 bp；同时以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为阳性内对照，GAPDH的上游引物为5′CCACCCATGGCAAATTCCATG 3′，下游引物为 5′TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC 3′，扩增片段长度为574 bp。PCR条件为94℃预变性3 min，94℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，共 35个循环，72℃延伸 7 min，PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5 Western blot检测HBx与YKL-40蛋白的表达情况：每孔细胞收集后加入200μl细胞裂解液，200 W超声破碎10 s，4℃、16 000 r/min离心2 min，取上清进行蛋白定量，按20μg/孔行12%SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗（1∶500稀释），4℃过夜；PBS洗涤 3次，5 min/次，加入酶标二抗（1∶500稀释），室温 2 h；PBS洗涤 3次，5 min/次，DAB染色。

1.2.6 细胞免疫荧光：细胞按上述3组于6孔板中进行细胞爬片，待细胞生长至50%~60%融合，取出玻片，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定10 min；PBS洗2遍，加入透化液静置10 min；PBS洗4遍，加入5%BSA封闭30 min；加入一抗（1∶50稀释），室温1 h；PBS洗4遍，加入荧光二抗（1∶50稀释），避光1 h；PBS洗4次，荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 siRNA表达质粒的构建

重组质粒测序结果确定siRNA模板已正确插入质粒，图2所示为重组质粒pRNAT-neg和pRNAT-HBx的测序图谱中截取的siRNA模板（测的是反义链）。

2.2 质粒转染及稳定细胞株的建立

质粒转染后24 h即可观察到GFP的表达，有限稀释法于96孔板中筛选到阳性单细胞克隆，扩大培养即获得稳定细胞株2215-neg和2215-HBx，荧光显微镜下照相，可见空白2.2.15细胞无荧光蛋白表达，而稳定细胞株2215-neg和2215-HBx均有GFP表达，见图3。

2.3 RT-PCR检测HB x和YKL-40 mRNA的表达

PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果（图4）显示，GAPDH作为阳性内对照，可见清晰条带；实验组细胞HB x和YKL-40的mRNA水平明显低于空白对照组及阴性对照组，而空白对照组及阴性对照组HB x和YKL-40的mRNA水平无明显差别，表明pRNAT-HBx可明显抑制HepG2.2.15细胞中HB x的mRNA表达，YKL-40的mRNA水平随HB x基因的下调而降低。

2.4 Western blot检测HBx和YKL-40蛋白的表达水平

Western blot结果（图 5）显示，β-actin内参照的表达均在同一水平，实验组细胞HBx和YKL-40蛋白的表达明显低于空白对照组及阴性对照组，而空白对照组及阴性对照组HBx和YKL-40蛋白的表达水平无明显差别，表明pRNAT-HBx抑制了HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达，YKL-40的蛋白水平随HBx蛋白的下调而降低。

2.5 细胞免疫荧光检测细胞内HBx和YKL-40蛋白的表达情况

荧光显微镜下，空白对照组及阴性对照组细胞质内均有很强的绿色荧光，而实验组细胞质内绿色荧光明显减弱。提示HBx和YKL-40在各组细胞内的蛋白表达情况与RT-PCR和Western blot结果一致，见图6。

3 讨论

HB x基因是HBV基因组中最小的阅读框架，在感染哺乳动物的HBV中高度保守，HBV感染后，病毒基因组常整合入宿主细胞基因组造成宿主细胞染色体不稳定。X基因是最常被整合的基因，大多数肝癌细胞株及HCC都含有部分或全部的HB x基因，整合形式的X基因产生HBx蛋白，分子量约17 kDa［5］。作为一种反式激活因子，HBx蛋白能激活宿主细胞和病毒自身基因的转录，调控细胞凋亡，抑制细胞中受损DNA的修复反应及激活细胞中信号转导通路。HBx蛋白本身不能与双链DNA直接结合，主要通过与宿主细胞中的蛋白发生相互作用，产生两方面的效应：一是通过与一些转录调控蛋白的相互作用，在转录水平上激活或抑制某些基因的转录；二是通过直接与控制细胞活力和增殖能力的调控蛋白及一些未知的细胞蛋白之间的相互作用，影响宿主细胞中这些蛋白的功能［6］。

YKL-40又名人类软骨糖蛋白-39，生理状态下可由巨噬细胞、中性粒细胞、软骨细胞、血管平滑肌细胞等分泌，在炎症相关性疾病及乳腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌、黑色素瘤等多种肿瘤组织中呈高表达，它在肿瘤细胞增殖、生存、侵袭力、肿瘤周围的炎性反应、血管形成、肿瘤细胞外基质的重建以及肿瘤转移中发挥着重要作用［7］。目前其对肿瘤细胞的具体作用机制还不十分清楚，有研究发现肝癌原发瘤细胞株H2-P中凋亡抑制基因Clusterin的导入可以明显上调YKL-40蛋白的表达，促进肿瘤细胞的体外迁移和体内成瘤及转移；而且在肝癌原发瘤和转移瘤组织中，YKL-40蛋白表达与Clusterin蛋白水平均密切相关。推测YKL-40可能是Clusterin基因作用的下游靶基因［8］。

HepG2.2.15细胞是转染了克隆的HBV-DNA的肝癌细胞系［9］，主要应用于体外遗传毒理学实验、外源性生物异物的细胞毒性、HBV感染机制等方面的研究。由于整合了HBV全长基因组，HepG2.2.15细胞能够稳定表达HBx蛋白。

siRNA是一种小RNA分子，由Dicer（RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA诱导序列特异的目标基因的沉默，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定mRNA进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA，其调控机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。

我们通过研究发现siRNA可明显抑制HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达，观察到YKL-40的mRNA、蛋白、细胞内蛋白的表达水平也随之相应下调，提示HBx蛋白可能在转录和翻译水平双方面影响YKL-40的蛋白表达。由此推断HBx蛋白在HepG2.2.15细胞中对YKL-40蛋白具有一定的激活作用，从而抑制HBx蛋白的表达，其对YKL-40蛋白的激活作用减弱，致使YKL-40蛋白水平降低到接近原来的水平。根据HBx的生物功能和类似研究［10］，猜测其可能通过NF-κB信号通路或者与蛋白翻译相关因子相互作用来影响YKL-40蛋白的表达，这还有待进一步研究证实。

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