郭志强，贾正平，马 骏，王 荣，李文斌，吴兰兰

（兰州军区兰州总医院药材科，兰州市 730050）

细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）同工酶代谢40%～50%的药物，是主要的药物代谢酶，具有基因多态性（Genetic polymorphisms）。尽管已知大约有30多种CYP450同工酶参与药物代谢，但占主导地位的酶类主要有4种：CYP2D6、CYP3A4、CYP1A2和CYP2C9/19[1～3]。

Wrighton从人肝脏中分离得到S-美芬妥英4′-羟化酶（S-MP），并将其命名为CYP2C19[4]。CYP2C19具有多态性，代谢表现为强代谢型和弱代谢型，强代谢型能迅速进行S-MP的4′-羟化代谢，弱代谢型则出现羟化代谢障碍。

CYP2C19 cDNA全长1940 bp，其中编码区为1473 bp，以ATG开始，以TGA终止[5]。本文研究的是第482 bp～第642 bp及第643 bp～第819 bp的编码区。

CYP2C19主要参与代谢的药物谱较为广泛，包括质子泵抑制剂、三环类抗抑郁药、抗癫痫药、抗精神病药、降糖药、抗凝药、抗疟疾药以及抗癌药等[6]。因此，研究CYP2C19基因多态性对CYP2C19参与代谢的药物具有重要的基础研究和临床指导意义。

由于我国各地区环境、气候及与其他民族交融情况不同，各地人口在遗传背景大致相似的基础上又各有特点，尤其是地处西北的甘肃，环境和生活条件与其他地区差异较大。因此，有必要研究不同地区CYP2C19基因的多态性。本文研究甘肃地区健康汉族人群CYP2C19的基因型和等位基因分布情况，并考察性别对CYP2C19基因多态性的影响。

1 材料

1.1 研究对象

由于CYP2C19的表型呈常染色体隐性遗传，有血缘关系的人群其基因型和等位基因分布受遗传影响而不能全面代表所考察人群的分布特征，所以选择无血缘关系的受试者。通过询问、记录受试者的家族史来评判其有无血缘关系。选择甘肃地区104例无血缘关系的汉族健康志愿者，其中男性51例，女性53例，年龄18～43岁，平均（29.0±4.2）岁。所有受试者无严重疾病史，经体格检查及常规检查均未见异常。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂：Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、25 mmol·L－1MgCl2均为美国MBI公司产品；基因组DNA提取试剂盒、10 mmol·L－1dNTPs、DNA分子量标准物DNAMarkerⅠ为天根生化科技（北京）有限公司产品；BamHⅠ、SmaⅠ限制性内切酶及其缓冲液购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2.2 仪器：PTC2150型PCR仪（美国MJ Research公司）；DYY-8C型电泳仪（北京六一仪器厂）。

2 方法

2.1 引物设计及合成

根据CYP2C19等位基因外显子5和内含子6以及外显子4和内含子5碱基序列（序列见NCBI数据库GeneBank NC_000010 REGION：96522463..96612671）用Primer Premier 5.0软件分别设计外显子5和外显子4的特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

外显子 5（*2）的引物为：上游 5′-AAT TAC AAC CAG AGC TTG GC-3′；下游 5′-TAT CAC TTT CCA TAA AAG CAAG-3′。

外显子4（*3）的引物为：上游5′-TAT TAT TAT CTG TTA ACT AAT ATG A-3′；下游 5′-ACT TCA GGG CTT GGT CAA TA-3′。

2.2 基因组DNA提取

取志愿者外周静脉血3 mL，采用DNA提取试剂盒进行DNA抽提，所得DNA于－20℃贮存，备用。

2.3 多聚酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析

2.3.1 PCR扩增：以前述提取所得基因组DNA为模板进行扩增。

2.3.2 CYP2C19*2位点扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72℃再延伸10 min。

2.3.3 CYP2C19*3位点扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72℃再延伸10 min。

2.3.4 PCR-RFLP分析：CYP2C19*2的等位基因扩增得到284 bp的片段，用SmaⅠ进行消化；CYP2C19*3的等位基因扩增得到375 bp的片段，用Bam HⅠ进行消化。酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外线灯下观察带型。

2.4 统计学方法

采用SPSS软件进行统计学处理，基因型频率和等位基因频率采用基因计数法计算，性别间的频率比较采用χ2检验，检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 PCR-RFLP分析结果

外显子5扩增产物为284 bp，突变发生在SmaⅠ的酶切位点，经SmaⅠ消化后，显示3种带型：野生型有171 bp、113 bp 2个片段，杂合子型有284 bp、151 bp、113 bp3个片段，突变型纯合子不能被切开而呈现284 bp的单一条带。CYP2C19m1的PCR扩增产物SmaⅠ酶切后电泳结果见图1。

图1 CYP2C19m1的PCR扩增产物SmaⅠ酶切后电泳结果1.wt/wt野生型纯合子；2.m1/m1突变型纯合子；3.wt/m1突变型杂合子；4.DNA标准分子量Fig 1 Electrophoresis of PCR products of CYP2C19m1 gene after digested by SmaⅠ1.wild-type homozygous（wt/wt）；2.homozygous for CYP2C19m1（m1/m1）；3.heterozygous for CYP2C19m1（wt/m1）；4.DNAmarker

外显子4扩增产物为375 bp，突变发生在BamHⅠ的酶切位点，经BamHⅠ消化后，野生型可被切成224 bp、151 bp 2个片段，杂合子显示375 bp、224 bp、151 bp 3个片段，突变型纯合子不能被切开而呈现375 bp的单一条带。CYP2C19m2的PCR扩增产物BamHⅠ酶切后电泳结果见图2。

图2 CYP2C19m2的PCR扩增产物BamHⅠ酶切后电泳结果1.DNA标准分子量；2.m2/m2突变型纯合子；3.wt/m2突变型杂合子；4.wt/wt野生型纯合子Fig 2 Electrophoresis of PCR products of CYP2C19m2 gene after digested by BamHⅠ1.DNA marker；2.homozygous for CYP2C19m2（m2/m2）；3.heterozygous for CYP2C19m2（wt/m2）；4.wild-type homozygous（wt/wt）

3.2 性别对甘肃汉族人CYP2C19基因型和等位基因频率的影响

本研究考察的CYP2C19基因型和等位基因频率未受到性别的显著影响，其基因型频率比较的χ2＝0.354，P＞0.05。汉族不同性别CYP2C19基因型和等位基因频数频率分布见表1。

3.3 甘肃汉族人CYP2C19代谢表型分布

基因型为*1/*1者其代谢表型属强代谢型纯合子（EMhomo）；基因型为*1/*2、*1/*3者其代谢表型属强代谢型杂合子（EMhete）；基因型为*2/*2、*2/*3、*3/*3者其代谢表型属弱代谢型（PM）[4]。汉族不同性别CYP2C19代谢表型分布见表2，χ2＝0.141，P＞0.05，可见性别对其无显著影响。

表1 汉族不同性别CYP2C19基因型和等位基因频数频率分布（n，%）Tab 1 The genotype and allele distribution of CYP2C19 in Han population with different gender（n，%）

表2 汉族不同性别CYP2C19代谢表型分布（n，%）Tab 2 The phenotype distribution of CYP2C19 in Han population with different gender（n，%）

3.4 不同地区间比较

本研究结果表明，甘肃汉族人群CYP2C19基因型与代谢表型存在多态性，而性别对此多态性无显著性影响。甘肃汉族人群CYP2C19基因型及等位基因频率与北京地区汉族人群[7]略有差异但基本一致（详见表3），χ2＝1.738，P＞0.05，表明两地区间差异并不显著。

表3 不同地区汉族CYP2C19基因型和等位基因频数频率分布（n，%）Tab 3 The genotype and allele distribution of CYP2C19 in Han population from different areas（n，%）

4 讨论

本研究考察甘肃汉族健康人群CYP2C19基因多态性和性别对其的影响，充实了我国人口和该基因的生物多样性数据。随着药物基因组学在个体化药物治疗研究中的飞速进展，这必将为更好地选择药物配伍、调整药物剂量、预测药物不良反应提供理论和技术支持，进而缩小相应药物疗效的个体间差异，提高药物使用效率，减少药害事件的发生，最终提高个体化药物治疗水平。本研究考察样本量尚显不足，检出突变型纯合子较少，可继续积累样本并对其表型作进一步研究。

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[3]张 健，朱晓东，卫敏刚，等.上海市544例学龄儿童CYP3A酶活性分布初探[J].中国药房，2005，16（20）：1560.

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