高 立，祁小乐，高玉龙，高宏雷，秦立廷，邓小芸，李 凯，王笑梅

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001)

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD病毒(IBDV)引起的一种危害鸡的急性、高度接触性传染病[1]。超强致病性IBDV(vvIBDV)经传代致弱能够感染非允许细胞鸡胚成纤维细胞(CEF)，通过病毒碱基突变不仅有助于了解IBDV的遗传变异机制，而且对于研发新型疫苗意义重大。近年来，IBDV遗传变异和细胞嗜性等分子基础研究取得了一些进展[2-4]。VP2被认为是决定病毒细胞嗜性的基因[5-6]，然而，其具体的分子机制尚存在争议。我国在这方面的研究尚未见报道。本课题组利用已建立的IBDV反向遗传操作系统[7]，对IBDV细胞嗜性的分子基础进行分析和预测。本研究借助该操作技术，对国内地方分离的vvIBDV，通过定点突变和重叠延伸PCR(SOE-PCR)等技术，研究定位vvIBDV的VP2基因突变对细胞嗜性改变的影响。

1 材料和方法

1.1 重组质粒及单克隆抗体(MAb) 重组质粒pT-HLJ0504A、pT-HLJ0504B(分别含有 vvIBDV分离毒株HLJ-0504全基因组的A、B节段)由本课题组构建保存；IBDV VP2 MAb由本课题组制备。

1.2 主要试剂 DpnⅠ酶购自NEB公司；Plasmid Midi Kit购自QIAGEN公司；LipofectamineTM2000和SuperscriptTMRT-PCR Systems试剂盒购自英俊生物技术有限公司；Opti-MEMⅠMedium购自GIBCO公司；FITC标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司。

1.3 引物设计与合成 实验中所用引物见表1，引物由英俊生物技术有限公司合成。

1.4 感染性分子克隆的构建

1.4.1 核酶结构的引入 参考文献[7]的方法，以AU01/AL01、AU02/AL02和AU02/AL03为引物，分3步在基因组A节段的5'端引入HamRz(5'-TGTT AAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATA GGAAAGGAATTCCTATAGTC-3')，3'端引入 HdvRz(5'-GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGT CCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG-3')。将最终PCR产物命名为HLJ0504AHRT。将其克隆于pMD18-T载体，重组质粒命名为pT-HLJ0504AHRT。……