郑 君，李建华，张西臣，宫鹏涛，李明英，刘颖丽

(吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062)

隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种由隐孢子虫感染而引起的以腹泻为主要临床症状的原虫病，可寄生于哺乳类、爬行类等多种动物和人，引起严重腹泻、脱水和厌食等症状[1]。安氏隐孢子虫(Cryptosopridium and ersoni)主要感染断奶犊牛、育成牛和成年牛[2]。目前，对安氏隐孢子虫囊壁蛋白的研究主要集中在虫体的诊断上[3]，本研究以安氏隐孢子虫长春株囊壁蛋白部分编码基因为对象，构建了重组原核表达载体pET28a-AB，并通过大肠杆菌进行表达，从而鉴定目的基因的免疫原性和免疫反应性，为安氏隐孢子虫的防治提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 虫株与实验动物 安氏隐孢子虫卵囊为吉林某奶牛场粪样中分离纯化，用2.5%重铬酸钾溶液4℃保存。10只雌性BALB/c小鼠，6周龄～8周龄，体质量20 g左右，实验小鼠均在清洁级动物房饲养。

1.2 菌株、质粒和化学试剂 pMD18-T载体和工具酶购自TaKaRa公司；pET-28a由本实验室保存。E.coliTop10与E.coliBL21(DE3)均购自天根生物公司；抗His标签单克隆抗体、HRP标记羊抗小鼠IgG二抗均购自天根生物公司；层析柱材料Ni2+-NTA购自Novagen公司。

1.3 目的基因AB重组表达载体的构建 根据Gen-Bank中登录的安氏隐孢子虫囊壁蛋白(COWP)基因的核苷酸序列(AB089289)，设计特异性引物：上游引物：5'-CGCGGATCCTTTACATTTTCAGGGAAGC-3'(含BamHⅠ酶切位点)；下游引物：5'-CCGGAATTC CCTTGCAGTGTAAAATTTG-3'(含 EcoRⅠ酶切位点)。RT-PCR扩增目的基因(AB)，回收RT-PCR扩增产物，经TA克隆及鉴定，构建重组质粒pET-AB，双酶切鉴定并测序。

1.4 重组质粒pET-AB在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达及纯化 参照文献[4]的方法，诱导重组菌，分别表达1 h、2 h、4 h和6 h，SDS-PAGE检测表达产物，收集菌体，通过Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白，以抗His抗体(1∶4000)和安氏隐孢子虫免疫小鼠血清(1∶250)分别作为一抗，western blot分析纯化的重组蛋白。……