葛淑敏，钱爱东，王铁风

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022)

非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria，NTM)是指除结核分枝杆菌及麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。NTM广泛存在于自然界，如空气、土壤、动物体表及体液等[1]。致病性较弱，可为呼吸道的正常寄生菌，但可在局部或全身抵抗力下降时成为条件性致病菌[2]。为进一步了解牛群中NTM感染情况，本实验对10株牛源NTM菌株进行了16S rDNA基因序列分析鉴定。

1 材料和方法

1.1 实验材料 10株牛源NTM分离株由本室分离保存(来自吉林省)，分别命名为 N1～N10，其中N3、N8、N9与N10分离自牛颌下淋巴结样品，其他分离株均分离自牛肠系膜淋巴结样品。

1.2 DNA提取 采用酚-氯仿抽提法提取DNA，参照常规方法进行。提取的DNA于-20℃保存。

1.3 16S rDNA基因扩增 根据16S rRNA基因高变区序列[3]设计合成1对引物(由上海生物技术有限公司合成)，上游引物P1：5'-CACATGCAAGTCGA ACGGAAAGG-3'和下游引物P2：5'-GCCCGTATCG CCCGCACGCT-3'；扩增16S rRNA基因5'端约570 bp左右片段。PCR反应体系为 20 μL：10×ExTaq Buffer(含 Mg2+)2 μL、dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1.5 μL、上、下游引物 P1/P2(10 μmol/L)各 0.5 μL、DNA 模板 1 μL、ExTaq(5 u/μL)0.25 μL，H2O 14.25 μL。PCR扩增程序为：95℃5 min；94℃30 s、63℃ 30 s、72℃1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4 PCR扩增产物纯化及序列测序 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收，并由宝生物工程(大连)有限公司测序。

1.5 DNA序列分析 将16S rDNA测序结果与GenBank中登录的相关序列比较[4]。本实验所用标准16S rDNA序列分别为：母牛分枝杆菌(M.vaccae)，登录号：AF480591.1；新金色分枝杆菌(M.neoaurum)，登录号：FJ172309.1；偶发分枝杆菌(M.fortuitum)，登录号：DQ973806.1及浅黄分枝杆菌(M.gilvum)，登录号：AB491971.1。

2 结果与讨论

2.1 16S rDNA片段PCR扩增结果 10株NTM菌株均扩增到一约570 bp目的片段,与预期扩增片段大小相符。

2.2 NTM菌株16S rDNA序列分析……