李璐璐，王春芳,3，任 飞，刘新宇，宁浩然，刘 磊，李冰洁，姜秀云,3*，何昭阳

(1.吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；3.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，吉林 长春 130118)

牛结核病(Bovine tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种慢性、消耗性人兽共患传染病。由于缺乏特异而敏感的诊断试剂及有效的预防疫苗，近年来该病在全球范围内的流行呈上升趋势[1]。MPB51[2]和MPB63[3]是结核杆菌的主要分泌蛋白。其中，MPB51存在于CD4+T和CD8+T细胞免疫优势抗原表位[4]，并且在免疫诊断中具有高度的特异性[5]。MPB63只存在于结核杆菌复合群中，能够与豚鼠阳性血清产生强烈的反应[6]。两者可以作为结核病的诊断抗原及疫苗的候选抗原。

研究表明，以M.bovis多基因融合表达的融合蛋白作为诊断抗原，提高了诊断的敏感性和特异性[7-8]。另外，融合蛋白免疫的小鼠血清抗体水平高于卡介苗免疫，并且免疫效果显著高于单一抗原[9]。为提高单一抗原的抗原性，采用重叠延伸(SOE)拼接PCR技术将M.bovis mpb51和mpb63基因融合，并在大肠杆菌中进行表达，为进一步研究mpb51-63融合基因及其表达产物作为新型DNA疫苗、亚单位疫苗及诊断抗原奠定基础。

1 材料和方法

1.1 载体、质粒与细菌株 pMD18-T为TaKaRa公司产品；pGEM-T-51、pGEM-T-63、pET28a(+)、E.coliJM109及BL21(DE3)均由本实验室保存。

1.2 主要试剂 Pyrobest DNA Polymerase、LATaq DNA聚合酶、BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；辣根过氧化物酶(HRP)购自Roche公司产品；牛结核多克隆抗体为临床结核病牛血液分离的血清；HRP标记兔抗牛IgG二抗由本实验室制备并保存。

1.3 引物的设计与合成 根据mpb51、mpb63的基因序列，设计如下引物：P1：5'-TAGGATCCACCA TGGCCCCATACGAGAA-3'；……