胡枫江,姬少龙,赵媛媛,闫万峰,江 敏,胡建东

(1.河南农业大学机电工程学院,河南郑州 450002;2.河南农大迅捷测试技术有限公司,河南郑州 450002;3.河南农业大学生命科学学院,河南郑州 450002)

光学表面等离子共振(Surface plasomon resonance,SPR)生物传感技术以其实时监测、无需标记、非破坏性探测和耗样量少等特点在农业、食品安全监测、药物筛选、临床医学及环境监测等领域得到越来越广泛的应用[1～3].研究人员就构建光学表面等离子共振生物传感器的光源、光学扫描机构、芯片系统、微流通池装置、光电信号检测等方面进行了研究,相继研发了不同类型的光学 SPR生物分析仪[4].但这些仪器体积大,携带不便,价格昂贵,阻碍了光学 SPR生物分析仪的推广使用[5].随着中国生物分析技术的发展,对高通量、非破坏和无需要标记的便携式光学 SPR生物分析仪的需求日益迫切,急需要研究出低成本、非扫描式的光学 SPR生物分析仪.光学 SPR生物分析仪可分为棱镜型、光栅型、光波导型和光纤型等结构,光学SPR光谱信号调制方式又有波长调制型、角度调制型、相位调制型和强度调制型等[6～10].目前,低成本的光学 SPR生物传感器有些选择发光二极管(LED)为光源,克服了光学干涉所产生的影响,但LED光源线宽大,光稳定性随电源电压波动强,光强弱,所获得的光学 SPR共振图像不够清晰,光电信号处理困难和检测系统成本高.作者设计的一字线型激光器式光学生物传感器使光学 SPR生物分析仪小型化、低成本,可获得高质量,重复性好的响应结果,可提高生物样本的分析效率.

图1 光学SPR生物传感器结构示意图Fig.1 A schematic structure of an optical SPR biosensor

1 一字线型激光器式光学生物传感器设计原理

一字线型激光器式光学 SPR生物传感器主要由光源、光学 SPR芯片和 CCD光电检测器 3部分组成.光源由一字线型激光器(波长 650 nm)和光学偏振片组成,光学 SPR芯片由表面蒸镀有 50 nm金膜的光学直角棱镜和微流通池组成,CCD光电检测器由 1 024个像素的线阵 CCD和数据采集器组成(图 1).一字线型激光器式光学生物传感器为非扫描性等效于角度调制型光学 SPR生物传感器,固定激光器和入射波长,将一字线型激光器发出的激光光束以一定角度穿过直角棱镜入射到棱镜与金膜的界面,光线从该界面产生全反射,线阵CCD收集从棱镜反射回来的光强信号,经过 A/D转换后通过 RS232接口传给上位机,上位机实时显示采集到的数据并通过动力学分析获得光学SPR共振曲线.分析反射光信号强度最低点在线阵CCD上的像素位置或对应的光学响应值与被测样品折射率之间的关系,从而获得待测样品的折射率值,样品的折射率值与附着在芯片表面的物质量相关,检测折射率的值就可以获得被测物的浓度值,合适的入射光的角度,可以得到分辨率为1×10-6RIU.

通过对多种型号的激光器进行试验筛选,选择型号为 ST650UL5G,波长为(650±5)nm的一线激光器(直径 16 mm×45 mm),它的光线质量相对较好,光斑 50～100 mm,线宽 3 mm,线长度 10～20 mm,激光光束经透镜后的输出光线张角为 10°～135°.选择BK7等腰直角三角棱镜,等腰直角三角棱镜容易固定,可缩短光路,便于小型化,棱镜端面镀有 50 nm厚的金膜,此传感器中的光学 SPR生物芯片具有可更换性.光学SPR生物分析仪的重要组成部件是光学 SPR生物传感器,而其光学 SPR生物芯片的制造成本和生物芯片的可更换性是其关键.在直角三角型棱镜端面蒸镀 50 nm金膜,可提供一种制备方便和成本低廉的快速更换生物芯片的分析体系.微流通池采用塑料基底,通道的进出管路为不锈钢管,整个传感器处于恒温控制系统内,设定的控制温度为 25℃,每个微流通池装置设 3个通道,可同时检测 3种被测样品或者 1个通道设置为参考通道,用于实测样品时作标准光路用.每个通道长 100 mm、宽 1 000μm、直径为 500μm.图1中的一字线型激光器光束,经过偏振片后产生 P偏振光,入射进入等腰直角棱镜,在棱镜端面形成一条平直光线.试验时,直角棱镜端面(金膜表面)上压上微流通池,其通道与金膜的长边平行,使微流通池的通道完全覆盖入射光在棱镜端面形成的平直光线.全反射后光线照射到 CCD上时形成直线型光斑,当微流通池中通有待测液体时,由于光学 SPR现象,必然有某一角度的入射光线在棱镜端面产生表面等离子波共振,形成光学 SPR共振吸收峰,根据CCD检测到的不同像素位置的光响应值,可间接获得由像素位置表示的光学SPR共振角度.

2 材料与方法

2.1 乙醇溶液的配置

配制体积分数分别为 0.13,0.14,0.15,0.16,0.17,0.18,0.19的 10.00 mL系列乙醇标准溶液.

2.2 棱镜端面的金膜清洗

将带有金膜的棱镜置于体积分数为 4%的SDS溶液中,用超声波清洗约 30 min后取出,用去离子水冲洗金膜表面,再用 N2吹干备用.

2.3 试验方法

试验采用的试剂为去离子水和不同体积分数的乙醇,把试验平台放置于暗箱中,减小外来光线和电磁信号干扰.试验步骤如下:(1)固定一字线型激光器、CCD及驱动器,使入射至每个像素位置的入射光束和反射光束的光程相加相等,用滴管吸取少量的去离子水或乙醇溶液滴在棱镜端面的金膜上,尽可能地完全覆盖金膜.(2)旋转调整激光器,使激光光束通过全反射后照到 CCD表面,此时通过上位机观察获得光学 SPR共振响应曲线.(3)观察光学 SPR曲线是否出现最低点,即要寻找共振角,如无则继续调整激光器或 CCD的位置,直至获得理想的光学 SPR共振曲线为止.通过对不同体积分数的乙醇溶液的试验来验证光学表面等离子生物传感器的灵敏度,灵敏度反映单位体积分数的乙醇溶液产生的光学响应最低值大小.

首先用去离子水确定基线,待基线稳定后,依次滴入微流通池体积分数为 0.13,0.14,0.15,0.16,0.17,0.18,0.19的乙醇溶液分别试验,观察上位机上的光学 SPR共振曲线,待每个体积分数的乙醇溶液滴加至微流通池至信号稳定再读数,其中每完成1个体积分数的乙醇溶液测定后均用去离子水冲洗金膜表面进行再生,使传感器能够连续测量.

3 传感器性能测试

按照上述的试验方法,首先获得除离子水的光学 SPR共振曲线,图 2是直接由数据采集器获得的去离子水原始数据,其中光学响应值是 CCD检测到不同体积分数的乙醇溶液的电压与空气背景电压的相对值,由于光学传感器的密闭不严,或CCD受温度影响出现曲线不平滑,通过数据平滑处理后获得的去离子水光学 SPR共振曲线如图 3所示,此处采用的滤波方法是取某一像素点前后各10个数据进行平均作为该点值,滤除了检测系统的噪声值.

按照去离子水的试验方法,依次进行体积分数为 0.13,0.14,0.15,0.16,0.17,0.18,0.19乙醇溶液的光学 SPR共振曲线试验,结果见图 4.

图 4中的不同体积分数的乙醇溶液光学 SPR共振曲线是经过平滑滤波后获得的,可见不同的体积分数乙醇溶液,其光学响应最低值是不同的,分别依次为 290,279,253,250,237,236,231.为了分析一字线型光学 SPR生物传感器的灵敏度,建立不同体积分数的乙醇溶液所对应的光学响应最低值关系,如图 5所示.随着乙醇溶液的体积分数的增加,光学响应最低值减小.

一字线型激光器式光学生物传感器的灵敏度是指被测乙醇溶液体积分数的变化相对于光学响应最低值的变化,灵敏度分析可以验证一字线型激光式生物光学生物传感器的使用性能,也反映该光学 SPR芯片的敏感度.光学响应最低点的值(OP)随着乙醇体积分数(V)的增加而减小,二者之间存在线性关系,拟合直线为 OP=418.86-1 025V,其相关系数为 -0.970 5,检测灵敏度为 1.025×103.

图4 体积分数分别为 0.13(a),0.14(b),0.15(c),0.16(d),0.17(e),0.18(f),0.19(g)的乙醇溶液光学SPR共振响应曲线Fig.4 The optical SPR responsecurve of ethanol at volume fraction 0.13(a),0.14(b),0.15(c),0.16(d),0.17(e),0.18(f),0.19(g)respectively

图5 乙醇溶液光学响应最低值与其体积分数之间的关系曲线Fig.5 The optical resonance dip-value as a function of ethanol volume fraction

4 结论

一字线型激光器式光学生物传感器,减少了角度调制的可动部件,解决了由于角度动态调整而产生的噪声,提高了光学 SPR生物传感器的稳定性.传统的光学 SPR生物传感器的芯片为玻璃片表面蒸镀金膜结构,使用时将镀有金膜的玻璃片贴至棱镜端面构成光学 SPR生物传感器,镀有金膜的玻璃片与棱镜端面的贴合要求致密无空气间隙,调试费工费时.本研究提出了光学棱镜端面蒸镀金膜的光学 SPR芯片结构,可以实现光学 SPR生物传感器的芯片快速更换,与传统的光学 SPR生物传感器相比大大降低了制造成本.通过对不同体积分数的乙醇溶液试验,结果表明,一字线型光学 SPR生物传感器的灵敏度为 1.025×103,一字线型激光器式光学生物传感器结构紧凑、性价比高,由此构成的光学 SPR生物分析仪具有良好的推广使用前景.

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